北京耐多药肺结核控制项目试验室相关问题(1).pptx

结核病细菌学检验的标准化与新诊断技术进展,王甦民2022年4月,第一页，共七十四页。,强化结核病实验室诊断标准化的必要性,1、全球结核病控制的三大挑战：耐药结核病、HIV/艾滋病合并结核病、移民流动人口2、我国结核病疫情依然严重3、目前结核病实验室诊断技术的缺乏,第二页，共七十四页。,第三页，共七十四页。,分类,结核分枝杆菌属原核生物界、厚壁菌门、裂植菌纲、放线菌目、分枝杆菌科的分枝杆菌属，分枝杆菌属种类甚多，目前已命名的有200多种，一般可分为缓慢生长和快速生长两大类。,第四页，共七十四页。,结核分枝杆菌特点,结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需要10-20小时细胞壁厚度为1035nm，较一般细菌的细胞壁厚，含有大量脂类，具有坚韧性和疏水性。抗酸性是分枝杆菌的重要特征。,第五页，共七十四页。,结核病细菌学检查的重要作用,细菌学检查是结核病最客观、最科学和最重要诊断方法和流行病学研究工具。因此结核病的实验室检验仍然面临着较多的问题。,第六页，共七十四页。,细菌学检验存在的问题,不易于标准化操作误差较大可到达30%1、个人操作误差 2、标本性状 3、标本来源对结果的理解差异可影响检验结果对临床治疗的参考或指导意义。,第七页，共七十四页。,主要的细菌学检验技术,1、痰涂片抗酸染色、镜检技术2、分枝杆菌别离培养技术3、分枝杆菌快速培养技术4、药物敏感性实验技术5、分枝杆菌菌种鉴定技术,第八页，共七十四页。,标准的痰涂片抗酸染色、镜检技术,标本的收集，特别是痰标本的采集、保存制片和染色过程的标准化读片操作的熟练程度和标准化对结果的理解,第九页，共七十四页。,痰标本的采集、保存和运送,脓样、干酪样或脓性粘液样痰为合格标本，痰量应为3-5毫升。难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，以供分析结果时参考。容器上应注明与检验单一致的病人姓名、编号及日期。不能及时检验的痰标本应置4C冰箱保存，如需转运，外送前要认真核对检验单与痰瓶上标注，放在专用的转运箱内运送。,第十页，共七十四页。,标本的采集,标本留取方法痰标本的留取应在医护人员的指导下进行。医护人员应告知病人如何咳痰，合格的痰标本是深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物，并说明唾液检出的可能性很小。检验人员检查痰标本的性状，并在登记本和检验报告单上注明按干酪痰、血痰、黏液痰和唾液分类登记。,第十一页，共七十四页。,如何正确留痰,查痰对于结核病的诊断是非常重要的，通过痰检可以知道您是否痰中带菌。如果痰中带有结核菌说明您患有肺结核，具有传染性，应该及时遵医嘱治疗。送检痰标本的质量直接影响检验结果的准确性。请您一定按照以下要求和方法留取合格的痰标本。每个痰盒应分别留取12口痰，请不要将1口痰分开放到2或3个痰盒中。正确的咳痰方法：1、咳嗽前应缓慢地深吸气，吸气后稍屏气片刻。2、躯干略向前倾，两侧手臂屈曲，平放在两侧胸壁下部，内收并稍加力。3、咳嗽时腹肌用力快速收缩，使腹壁内陷。一次深吸气，可连续咳嗽三声。4、停止咳嗽后，收缩腹肌将剩余的气体尽量呼尽。5、重复缓慢吸气动作或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的动作。*注意：局部人如果突然深吸气容易诱发咳嗽，您可以尝试缓慢或分几次吸气，争取肺泡内充分充气，以增加咳嗽的效率。在这一过程中，要注意动作的连贯性，一气呵成。同时，也可以叩击前胸，或由家属协助叩击后背胸壁。这样震动支气管内的分泌物，能够增加咳嗽排痰的力度。,第十二页，共七十四页。,直接痰涂片检查法,萋尔-尼尔逊氏ZiehlNeelsen抗酸染色法 热染法,第十三页，共七十四页。,细菌学常规检查 直接涂片法,操作流程,涂痰膜自然干燥,复红加热初染5分钟,自然干燥镜检,流水冲洗,美兰复染30秒,盐酸酒精脱色,流水冲洗,流水冲洗,第十四页，共七十四页。,载玻片,一新载玻片必须经95%乙醇脱脂，检查无划痕后 方可使用。二一张载玻片只能涂抹1份痰标本。三载玻片只允许一次性使用，严禁清洗后重复用于AFB检查。四载玻片正面一侧1/3处标注实验室序号(如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用2B铅笔在磨砂面上直接书写)。五载玻片正面另一侧2/3中央处均匀涂抹成面积为1020 mm的卵圆形痰膜。,第十五页，共七十四页。,染色,一严格按照操作标准完成染色程序。二染色后的痰膜应呈均匀亮蓝色，无红色斑块。三将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，那么说明该玻片涂抹过厚，或染色过程有误。四染色后的痰膜脱落局部应小于整个涂抹面积的10%。,第十六页，共七十四页。,一为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触玻片上的痰膜。二仔细观察300以上的视野。三每个工作日，一名镜检人员的玻片阅读量一般不应超过25张。四连续阅读1012张玻片后，应休息20分钟左右。,镜检读片,第十七页，共七十四页。,痰涂片抗酸菌浓度与阳性结果机率 检出菌数 每毫升标本估算菌数 阳性结果机率0/100或更多视野 1000 101-2/300视野 5000-10000 501-9/100视野 约30000 801-9/10视野 约50000 90cv1-9/每视野 约100000 96.2cv10或更多/每视野 约500000 99.95cv,第十八页，共七十四页。,查痰次数与阳性机率关系为什么诊断前强调三涂两培3S 2C 1 2 3 4 5,第十九页，共七十四页。,细菌学常规检查 直接涂片法,显微镜检报告方式：0条/300视野：萋-尼氏抗酸杆菌阴性1-8条/300视野：实报菌数3-9条/100视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性+1-9条/10视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性2+1-9条/1视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性3+10条/1视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性4+,第二十页，共七十四页。,细菌学常规检查 直接涂片法,本卷须知：选择痰标本中脓性、血样、干酪样的局部涂片阳性率较高；一张玻片只涂一份标本，玻片一次性使用，防止交叉污染；翻开痰盒、涂抹痰膜时容易产生气溶胶，应注意正确操作和自身防护；石炭酸复红初染时必须加温。,第二十一页，共七十四页。,细菌学常规检查 直接涂片法,优点：是直接发现原菌的检查方法，适用于痰、尿、便、体液、组织等几乎一切标本，有重要的临床诊断价值。是发现和确定传染源的重要途径，是考核和评价疗效的重要指标，有重要的流行病学意义；操作简便，价格低廉，适于各级实验室开展；快速，数小时可报告结果。,第二十二页，共七十四页。,细菌学常规检查 直接涂片法,缺点：敏感性低：通常每毫升含5000-10000条以上抗酸菌才可得到阳性结果；特异性较低：只能报告“抗酸菌阳性，不能区分结核和非结核分支杆菌；镜下只能观察菌体形态，不能区分死、活菌。,第二十三页，共七十四页。,涂片镜检质量保证系统 室内质控,标本收集、染色液制备、涂片染色程序、显微镜镜检、显微镜的保养和维护、结果的报告和登记、痰片的分类保存等应按照国家参比实验室的统一标准严格进行操作。复查方式：自查：试验员当日对已查涂片抽样复查。互查：由本实验室其他试验员抽查当日10%涂片。,第二十四页，共七十四页。,涂片镜检质量保证系统室间质控,以现场和非现场督导为主要方式。现场督导：质控实验室人员赴被质控实验室就实验室布局、平安防护、污染物处理、涂片染色操作、显微镜维护状况、日常实验记录等进行考核和指导，并以盲法、按比例抽取涂片复查。非现场督导：防治人员依据盲法、按比例的原那么抽取涂片交实验室复查。,第二十五页，共七十四页。,复检玻片样本量,1.样本量估算：盲法复检的关键是复检结果能否真正代表被督导实验室的实际水平。世界卫生组织推荐80%灵敏度、100%特异性针对阴性玻片、误差为0的可接受数量以及95%可信限样本量表，可以极大地减少样本量，保证了盲法复检在统计学意义上可以代表被评估实验室的总体水平。,第二十六页，共七十四页。,复检样本量计算表,第二十七页，共七十四页。,复检样本量计算表说明：,a、玻片阳性率：指所有检测的玻片中阳性玻片的比例平均阳性率。b、上一年阴性玻片总数：每年玻片的总数减去全年阳性玻片数。c、抽样时，当上一年阴性玻片数量和玻片阳性率不在选择点，阴性玻片数值采用区间上限，玻片阳性率采用区间下限。,第二十八页，共七十四页。,复检结果评价,盲法复检的目的不是为了验证某个病人诊断正确与否,而是评价整个实验室操作水平。评价的内容除了玻片镜检结果存在的误差之外，还包括检查标本的质量合格标本与不合格标本的比例、涂抹的大小和厚度、染色质量如何等,以便采取纠正措施，提高实验室的工作质量。,第二十九页，共七十四页。,1.误差分类：分为定性误差和定量误差1定性误差包括高假阳性和高假阴性高假阳性High False Positive HFP：阴性片被错误地判读为2以上的阳性。高假阴性High False Negative HFN：2以上的阳性玻片被错误地判读为阴性。,第三十页，共七十四页。,2定量误差包括量化误差、低假阳性和低假阴性量化误差Quantification Error，QE：同一张阳性玻片初检者和复检者阳性判断级别的差异。低假阳性Low False Positive，LFP：阴性玻片被错误地判断为1及以下的阳性。低假阴性Low False Negative，LFN：1及以下玻片被错误地判断为阴性。,第三十一页，共七十四页。,常见“误差原因,第三十二页，共七十四页。,实验室诊断的新进展,1、扩大开展液体培养和药敏试验2、引入现代分子生物学快速检测技术3、引入现代免疫学快速检测技术,第三十三页，共七十四页。,1、现代分子生物学检测主要技术,实时荧光定量PCR环介导等温扩增基因检测(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)分子线性探针Hain 技术(2022WHO推荐)基因芯片技术GeneXpert MTB/RIF 快速诊断技术,第三十四页，共七十四页。,1.1聚合酶链反响PCR,PCR诞生于1985年，由美国 Muliis等创造。PCR是一种根据脱氧核糖核酸DNA复制原理而设计的体外DNA或核糖核酸RNA扩增方法，由高温变性、低湿退火及适温延伸等反响组成一个周期，经过n个周期后，理论上可以获得2n双链DNA分子，使DNA特定区段大量扩增。此检测技术灵敏度高、特异性强、简便、快速，但也存在假阴性、假阳性、污染等方面的问题，研究人员对其进行了不懈的研究，使该技术不断得到改善，新的PCR及其衍生技术不断建立。,第三十五页，共七十四页。,实时荧光定量PCR,实时定量PCR(Real Time Quantitative PCR)是指在PCR反响体系参加荧光基团，利用荧光积累能够监控PCR扩增的每一个循环，在靶扩增的同时可获得定量的结果.即在同一个反响体系内完成扩增和扩增产物的检测,从而省去了靶扩增后复杂的定量检测工作。,第三十六页，共七十四页。,实时荧光定量PCR,该技术的优势在于其扩增产物的自动和实时检测,减少了常规产物检测步骤,也减少了人工判断结果的主观性，提高了结果的客观性和可比较性。同时工作效率大大提高。研究发现，该方法的特异性和敏感性较普通有所提高。与Southern杂交和酶促化学发光技术检测的灵敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。,第三十七页，共七十四页。,1.2环介导等温扩增基因检测(Loop mediated isothermal amplification，LAMP),检测是连续等温进行的。扩增效率十分高，反响灵敏。采用4条引物，识别6个位点，特异性强。不需要特殊的试剂与仪器，总费用很低。反响不需要开盖，在一管内完成全部检测。利用Bst酶的链置换功能进行反响。参加反转录酶，可以完成的一步法检测。,第三十八页，共七十四页。,Purification for Ultra Rapid Extraction(PURE),LAMP 方法,PURE 方法,等温反响高扩增效率高特异性实验周期短(几乎一个小时),简单去除核酸扩增抑制因子缩短处理时间,Pre-treatment kit,