制备了伤寒Vi多糖疫苗(1).pptx

细菌性疫苗,杨丽华 2022年3月,第一页，共九十五页。,1.死疫苗,2.活疫苗,3.蛋白类疫苗,4.多糖类疫苗,5.多糖蛋白结合疫苗,细菌性疫苗,国药长春所,第二页，共九十五页。,细菌性疫苗种类,国药长春所,第三页，共九十五页。,国药长春所,第四页，共九十五页。,白喉疫苗,一、白喉概述二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学四、白喉毒素五、白喉类毒素六、生产工艺七、类毒素的质量检定,国药长春所,第五页，共九十五页。,外毒素对神经系统损害,细菌产生的外毒素对心肌损害,外毒素对肾脏损害,白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病,主要临床表现为上呼吸道发炎，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，,白喉疫苗,国药长春所,第六页，共九十五页。,白喉流行特点,1.传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌 没有中间宿主，病人及带菌者是唯 一的传染原。2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通 过被污的器具和食物传播。3.易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿1岁时白喉易感性达顶峰。,国药长春所,第七页，共九十五页。,二、病原学,1.细菌形态 白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈 棒状，有着色较深的异染颗粒，革兰 氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚 膜，不形成芽孢。,国药长春所,第八页，共九十五页。,白喉棒状杆菌显微镜下形态,国药长春所,第九页，共九十五页。,国药长春所,白喉棒状杆菌显微镜下形态,第十页，共九十五页。,2.培养特性 白喉杆菌是需氧菌，最适温度为3435。能分解 葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能复原硝酸 盐，不产生吲哚，不消化蛋白。3.抵抗力.白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和 红霉素极敏感。.对消毒剂抵抗力弱，3苯酚10min可将该菌杀死.不耐热，58 10mi或100 1min即可被杀死。,国药长春所,二、病原学,第十一页，共九十五页。,三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学,1.致病力 自然界中动物不感染白喉，只能在敏感动物中造成 人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感实验 室常用的动物是家兔、豚鼠和NIH小鼠。2.毒素产生遗传学 白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的。白喉杆菌的产毒基因是由嗜菌体携带。嗜菌 体感染无毒白喉杆菌后嗜菌体DNA与细菌DNA整合，形成溶原性白喉杆菌而获得产毒能力PW8株目前 用于白喉类毒素生产)。,国药长春所,第十二页，共九十五页。,四、白喉毒素,1.白喉外毒素为棒状杆菌-噬菌体tox基因表达 产物,可与细胞外表的特异性受体结合,干扰蛋 白质的合成，对人和动物都引起致死性毒性，如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均 受到损害。2.白喉毒素是单一多肽，由560个氨基酸组成，分子量为62kDa,等电点pH4.1，在pH6时加热55 很快失活。3.通过物理和化学方法将其纯化。,国药长春所,第十三页，共九十五页。,毒素经甲醛处理后去除毒性 而保存免疫原性,五、白喉类毒素,国药长春所,第十四页，共九十五页。,甲醛浓度,PH,脱毒,影响脱毒因素,国药长春所,第十五页，共九十五页。,温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果,.温度越高脱毒越快，超过40影响抗原性，一般3738。.在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，在 保存过程中由于甲醛的继续作用，可导致脱 毒过甚，并影响毒素的稳定性；在碱性时脱 毒快，但抗原性损失较大，一般采用弱碱性。.甲醛浓度大那么脱毒快，但抗原损失大。,国药长春所,第十六页，共九十五页。,温度升高游离甲醛的浓度低毒素纯度高,提高甲醛浓度、脱毒pH、脱毒温度和延长脱毒时间；增加非蛋白氮含量于精制毒素中参加赖氨酸、精氨酸等,类毒素的毒性逆转,国药长春所,第十七页，共九十五页。,六、白喉疫苗工艺流程 菌种 PW8株 传代扩增 34代 发酵罐培养 3435培养对数生长 末期收获，甲苯杀菌。离心去菌体 收集清液 超滤浓缩 硫酸铵两段盐析 除盐除菌 氨离子及无菌检查 脱毒 甲醛液 37 脱毒试验家兔 原液 检定浓度、纯度、平安等 Al(OH)3吸附 成品 检定平安、效价等,国药长春所,第十八页，共九十五页。,七、类毒素的质量检定,1 絮状单位Lf 是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表“量 而不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定类毒素的絮状单位。絮状单位测定 毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度反响时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼可见的絮状凝集反响，根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位Lf值。2 纯度：1500Lf/mgPN3 平安性试验豚鼠,国药长春所,第十九页，共九十五页。,七、类毒素的质量检定,4效价测定 类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗 体的特异性结合反响。小鼠Vero细胞法 将标准和待检类毒素2倍稀释35个稀释度，皮下免疫N IH小鼠8只0.5ml/只)，免疫5周采血，根据vero细胞 生长情况，以标准品的效价为标准，用平行线分析法进 行结果计算。豚鼠毒素攻击法 皮下免疫豚鼠10只1ml/只，免疫4周后用毒素攻击，观察5天根据存活率以标准品的效价为标准，用平行线分 析法进行结果计算。,国药长春所,第二十页，共九十五页。,百日咳疫苗,一、百日咳概述二、病原学三、百日咳疫苗开展简史四、无细胞百日咳疫苗、生产工艺流程、质量检定、APV的效果、接种不良反响,国药长春所,第二十一页，共九十五页。,急性脑炎、呕吐、痉挛和昏迷，死亡或脑损伤,并发症肺炎形成肺气肿肺不张，甚至死亡。,营养缺乏症,百日咳是对儿童威胁非常大的传染病，它是由百日咳杆菌引起的一种呼吸道传染病。,典型病症为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有呕吐，可持续数月。,百日咳概述,国药长春所,第二十二页，共九十五页。,百日咳流行特点,1.传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳 病人是传染原。2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通 过被污的器具和食物传播。3.易感人群：主要传染对象是6岁以下儿童，1 岁以内婴幼儿发病率50%。,国药长春所,第二十三页，共九十五页。,二、病原学,细菌形态 百日咳菌呈革兰氏染色阴性，短杆状或椭圆形,国药长春所,第二十四页，共九十五页。,生长特性,1.百日咳菌可分四种相变，相菌毒力最强有免 疫原性；相菌毒力消失，无免疫原性；相菌介于 相之间。2.百日咳菌是需氧菌，最适温度为3536,最 适pH6.8-7.0。3.不发酵任何糖类、不分解糊精，尿素盐，不液 化明胶不产生吲哚，不利用枸橼酸盐。,国药长春所,第二十五页，共九十五页。,1百日咳相菌有两大类抗原 菌体O抗原 外表K抗原荚膜物质2百日咳菌可产生 外毒素(PT)内毒素 其他生物活性物质，据报道有25种之多。,、主要抗原和生物学活性,第二十六页，共九十五页。,百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 重患(FHA PT PRN Agg)下呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 细菌不进入组织和血液循环 干扰吞噬细胞功能 AC 分泌大量PT麻痹上皮细胞功能 TCT 产生血细胞增多损伤支气管血管周 HLT 细胞代谢发生变化 组织胺致敏性增强 围组织 分泌胰岛素增强和 血糖降低.,、致病机理,国药长春所,第二十七页，共九十五页。,三、百日咳疫苗开展简史,粗制百日咳灭活疫苗 第一次世界大战时期，在对病原菌的生物学构造及其 与 致病机理间的关系缺乏认识的前提下，凭经验制造的灭活 疫苗，工艺粗造、含量不确定。全菌体百日咳疫苗(WPV)以标准化方式生产的，制造疫苗的菌株必须含有123型凝 集原Agg1、Agg2、Agg3。经过50多年的临床应用证 明该疫苗的免疫效果是肯定的，但接种后的不良反响问题 一直未解决。无细胞百日咳疫苗(APV)20世纪80年代初期，对百日咳菌的成分及其所引起生物学 作用的认识，产生了APV。基因工程疫苗正在研究中。,国药长春所,第二十八页，共九十五页。,四、无细胞百日咳疫苗,1981年日本的佐藤教授等人在纯化出PT和FHA两种抗原的根底 上，在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百 日咳疫苗，并且与白喉和破伤风类毒素联合制成无细胞百白破 联合疫苗。该疫苗在日本开始正式使用，目前日本已经全部取 代了菌体百白破疫苗。1992年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。美国 获得生产许可证的APV还含有Agg2和PRN。目前WHO已经将其作 为儿童预防免疫推荐用疫苗。我国是于80年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗，90年代 中期获得正式生产文号。近期的临床试验证明含有5种保护性抗原PT FHA PRN Agg2 A gg3 的APV效果最佳答案。,国药长春所,第二十九页，共九十五页。,冻干百日咳菌种相CS菌株 接种血培养基大管培养 36 48-72小时培养 传代 接种发酵罐培养综合培养基 培养48小时 收集培养物 第一段硫酸铵盐析及浸提 第二段硫酸铵盐析及浸提 透析 密度梯度离心 戊二醛脱毒 透析 超声 无细胞百日咳原液,、生产工艺流程,国药长春所,第三十页，共九十五页。,、质量检定,国药长春所,第三十一页，共九十五页。,日本和中国的APV和DTPa按以上主要检定工程进行质量 控制。美国、欧洲一些国家及WHO推荐的毒性和效价测定方法 等与之不同。毒性试验仅要求做HST，效价测定采用EL ISA法检测疫苗注射小鼠后百日咳抗体应答水平。用小鼠脑腔保护力试验MPT评价疫苗效果，WPV 的 效价明显高于APV，而且并非所有的APV均可通过MPT试 验。因此还没有令人满意的针对APV疫苗的效价试验方 法。免疫原性试验在衡量制品的一致性方面是有用的，但 与临床保护之间还缺乏相关性。,国药长春所,效价测定方法探讨,第三十二页，共九十五页。,说明APV的保护效果是肯定的，能够到达WPA的保护水平。,、APV的效果,国药长春所,第三十三页，共九十五页。,说明APV的不良反响明显低于WPV。,、接种不良反响,国药长春所,第三十四页，共九十五页。,伤寒疫苗,一、概述二、病原学三、伤寒疫开展简史四、伤寒Vi疫苗,国药长春所,第三十五页，共九十五页。,1.伤寒病是一种急性全身性感染，感染网状内皮细胞系统，肠道淋巴组织及胆囊，病原是伤寒沙门氏菌。2.传播途径是食入被污染的食物或水源。3.学龄儿童发病率最高，两岁以下儿童和35岁以上成人发病率低。,一、概述,国药长春所,第三十六页，共九十五页。,典型的临床病症,国药长春所,第三十七页，共九十五页。,二、病 原 学,1.细菌形态 伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，能运动。,国药长春所,第三十八页，共九十五页。,伤寒沙门氏菌革兰染色,国药长春所,第三十九页，共九十五页。,伤寒沙门氏菌电镜形态,国药长春所,第四十页，共九十五页。,2.培养特性在肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜培养基上以易生长，需氧，适宜温度35-37，适宜的pH为7.07.2。发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气；不发酵乳糖、蔗糖；氧化酶试验阴性。,第四十一页，共九十五页。,1.鞭毛H抗原：为蛋白质，煮沸破坏，不受 1甲醛影响。2.菌体O抗原：细胞壁部份，耐热，为脂多 糖LPS由多糖重复寡 糖和核心寡糖和类脂A组 成。3.莢膜Vi抗原:即荚膜多糖CPS,是伤寒 杆菌细胞外壁的一种荚膜抗 原,Vi抗原与其致病性有关 Vi来源于毒力的缩写。,抗原结构,国药长春所,第四十二页，共九十五页。,血清学诊断,1.肥达氏试验widal test 选择抗原的方法：.测定O抗体 用伤寒0901株没有H和Vi抗原 用加热杀菌破坏H抗原不耐热.测定H抗体 用伤寒S株没有O菌体抗原 用甲醛处理伤寒沙门氏菌破坏O抗原 2.酶联免疫试验,国药长春所,第四十三页，共九十五页。,1,2,3,4,全菌体灭活疫苗,口服Ty21a减毒活疫苗,伤寒Vi多糖疫苗,伤寒结合疫苗,二、伤寒疫苗的开展简史,国药长春所,第四十四页，共九十五页。,1甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗,2.加热杀菌石碳酸防腐疫苗,3.丙酮杀菌疫苗,、全菌体灭活疫苗,国药长春所,第四十五页，共九十五页。,甲醛杀菌石碳酸