免疫细胞的分离与检测(1).pptx

一、免疫细胞的特征,1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性2、免疫细胞的膜分子特征 CD分子,第一页，共七十五页。,第二页，共七十五页。,NK cells,吞噬溶酶体,第三页，共七十五页。,第四页，共七十五页。,二、免疫细胞的别离技术,1、密度梯度离心法2、黏附别离法3、荧光激活别离法4、磁性别离法5、其他别离法,第五页，共七十五页。,1、密度梯度离心法,聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少局部细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中别离到单个核细胞。,第六页，共七十五页。,离心前,离心后,稀释抗凝血,淋巴细胞别离液,血浆,单个核细胞,粒细胞,红细胞,第七页，共七十五页。,2、黏附别离法-纯淋巴细胞群的别离,贴壁法：将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B细胞也有贴壁现象，用本法别离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。,第八页，共七十五页。,2、黏附别离法：淋巴细胞亚群的别离,尼龙毛法：混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞那么通过尼龙毛柱，这是获得富含T细胞群的有效方法。T细胞得率为20-30%左右。亲和板法：利用亲和层析法别离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞那么与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取。吸附柱法：将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大局部被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，对细胞极少损害。,第九页，共七十五页。,3、荧光激活别离法FACS,第十页，共七十五页。,流式细胞仪,第十一页，共七十五页。,4、磁性别离法,1磁铁吸引法：利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3m的羰基铁颗粒，置37温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。2磁激活细胞别离术MACs：是一种特异性细胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。主要组成成分为MACS微珠、MACS分选柱和MACS分选器。MACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒。MACS分选柱置于一个永久性磁场MACS分选器中，可以将磁力增强1000倍，足以滞留仅标记极少量微珠的目的细胞。用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。分选柱离开磁场，即可获得被标记的细胞组分。,第十二页，共七十五页。,MACS(阳性选择法,N,S,第十三页，共七十五页。,MACS(阴性选择法,N,S,第十四页，共七十五页。,第十五页，共七十五页。,第十六页，共七十五页。,5、其他别离法,花环沉降法：本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液别离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群那么富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，那么获得纯的T细胞。可溶性MHC-肽四聚体法：mhc-肽四聚体复合物的原理是通过增强t细胞受体与mhc-肽复合物亲和力，到达可直接特异性检测t细胞的目的。作为临床诊断工具，定量检测外周血及组织中抗原特异性CTLs的比率，并进行表型及功能分析。用于过继性肿瘤免疫治疗用于疫苗疗效的监测,第十七页，共七十五页。,抗原肽-MHC分子四聚体技术,第十八页，共七十五页。,MHC I类(左)和类(右)分子四聚体结构示意图,第十九页，共七十五页。,三、细胞的冻存与复苏,1、细胞冻存的原理与方法：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，引起细胞死亡。向培养液参加保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130以下的低温中能减少冰晶的形成。2、细胞复苏的原理与方法：细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜DMSO和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。,第二十页，共七十五页。,细胞冻存罐,第二十一页，共七十五页。,第二节 免疫细胞膜分子的检测,一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型二、免疫细胞膜分子的检测方法,第二十二页，共七十五页。,一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型,1、以抗体识别抗原2、以配体识别受体,第二十三页，共七十五页。,二、免疫细胞膜分子的主要检测方法,1、免疫标记检测方法 荧光抗体法 酶免疫检测法 免疫金银染色法2、补体依赖的细胞毒试验CDC3、花环形成试验,第二十四页，共七十五页。,SmIg的荧光抗体检测法,第二十五页，共七十五页。,SmIg的酶免疫检测法,第二十六页，共七十五页。,补体依赖的细胞毒试验CDC,染料,补体,第二十七页，共七十五页。,E-花环：利用T细胞膜上的异种动物红细胞受体,T细胞,B细胞,花环形成细胞,绵羊红细胞,第二十八页，共七十五页。,第二十九页，共七十五页。,EA-花环：B淋巴细胞外表有Fc受体，能与免疫球蛋白的Fc段结合，因此用抗体致敏的红细胞与B淋巴细胞混合，可见B淋巴细胞周围粘附有红细胞,第三十页，共七十五页。,EAC-花环：B淋巴细胞外表有补体受体，在抗体致敏的红细胞中参加补体，可形成红细胞-抗体-补体复合物，再与B淋巴细胞混合，那么可形成EAC玫瑰花环。,第三十一页，共七十五页。,第三节 免疫细胞功能测定,一、转化、增殖试验二、细胞毒试验三、抗体形成试验四、细胞吞噬与杀伤试验,第三十二页，共七十五页。,1、淋巴细胞转化试验：刺激物分为非特异性如植物血凝素、刀豆素A等和特异性刺激因子如抗原；检测方法为形态学检测法和3H-TdR掺入法及MTT法等。2、混合淋巴细胞培养：混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反响(MLR)常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。,一、转化、增殖试验,第三十三页，共七十五页。,第三十四页，共七十五页。,放射性测定,3H-TdR,丝裂原抗原刺激,淋巴细胞转化试验原理示意,小淋巴细胞在转化为原始母细胞过程中，合成DNA增加，能够吸收胸腺嘧啶核苷3H,第三十五页，共七十五页。,1、T细胞介导的细胞毒试验2、ADCC作用测定3、NK活性测定,二、细胞毒检测试验,第三节 免疫细胞功能测定,第三十六页，共七十五页。,放射性测定,细胞毒试验原理示意,靶细胞,效应细胞,别离上清,第三十七页，共七十五页。,2、K细胞活性测定ADCC活性测定,动物机体有些免疫细胞，通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用ADCC杀伤靶细胞，如NK细胞、活化的T细胞、吞噬细胞等，这类细胞统称为K细胞。K细胞的活性不仅反映机体细胞免疫的能力，而且与体液免疫也有直接的关系。K细胞活性检测的方法有同位素释放试验法，溶血空斑法，细胞剥离法和靶细胞接合试验。仅介绍同位素释放法。,第三十八页，共七十五页。,1原理,将靶细胞用51Cr标记后，再与特异性的IgG抗体结合，参加K细胞后即可发生ADCC效应，引起靶细胞的溶解并释放51Cr。用计数仪分别检测上清和细胞沉淀中的cpm，根据上清中释放的51Cr的多少，可判断K细胞活性的上下。,第三十九页，共七十五页。,2方法,1、试验管：效应细胞(淋巴细胞悬液)，标记的靶细胞(Cr51标记的鸡红细胞)和亚凝集单位的抗体(兔抗鸡红细胞抗体)各0.1ml，加RPMI 1640完全培养基1.7mlADCC。2、效应细胞对照管：效应细胞和标记的靶细胞各0.1ml加上述完全培养基1.8ml未加抗体。3、抗体对照管：标记的靶细胞和亚凝集单位的抗体各0.1ml，加完全培养基1.8ml未加效应细胞。4、最大释放对照管：标记的靶细胞0.1ml 加蒸馏水 1.9ml靶细胞会裂解，完全释放同位素。5、自然释放管：标记的靶细胞0.1ml，加完全培养基1.9ml靶细胞不裂解，但可自然释放一定量的同位素。以上各管均置37520h后，2500g离心10min，分别取各管上清夜1.0ml置于5支试管中，用计数仪测各管上清和沉淀中的cpm值。,第四十页，共七十五页。,3结果判断和计算,51Cr实验释放率%2(上清cpm本底cpm)100%(上清cpm-本底cpm)(沉淀cpm-本底cpm)51Cr 特异释放率%试验释放率自然释放率 100%最大释放率自然释放率,第四十一页，共七十五页。,3、NK细胞活性测定,NK细胞是具有天然杀伤靶细胞活性的淋巴样细胞，其杀伤作用不需要抗体、补体的参加，所杀伤靶细胞通常指肿瘤细胞和病毒感染或转化的细胞。这样，可以将来源于同种动物的肿瘤细胞系或病毒转化的细胞系，作为检测NK细胞活性的指示细胞。NK细胞活性测定多采用51Cr释放法试验，其原理同细胞毒性T细胞试验中所采用的51Cr释放法试验。在这里以检测小鼠脾脏NK细胞活性为例，说明本试验方法。用3H-TdR掺入法，靶细胞为YAC-1细胞株小鼠淋巴瘤细胞系。,第四十二页，共七十五页。,1试剂 小鼠脾细胞悬液:别离单个脾脏细胞-裂解红细胞-淋巴细胞洗涤配置悬液1640完全培养基2106/ml。标记的靶细胞：活淋巴细胞96%以上参加H3-Tdr-孵育2小时/每30min振摇-洗3次-配成2106/ml悬液。,第四十三页，共七十五页。,2方法 试验组孔：脾细胞悬液(淋巴细胞)：标记的靶细胞悬液100:1左右；对照组：单纯加标记的靶细胞。37 5%CO2培养18小时NK细胞杀伤靶细胞；每孔加终浓度为0.15%的胰酶和0.0125%DNA酶37处理30min消化细胞和处理掉死亡靶细胞释放出来的放射性DNA。各孔细胞收集后依次通过生理盐水，5%三氯乙酸和无水乙醇获得了存活的靶细胞的标记DNA。待滤膜枯燥后用液闪计数仪测定cpm值。三、结果计算 NK细胞活性以特异性杀伤率表示：特异性杀伤率%1试验组cpm/对照组cpm100%,第四十四页，共七十五页。,1、直接溶血空斑试验2、间接溶血空斑试验3、SPA-SRBC溶血空斑试验,三、抗体形成试验,第四十五页，共七十五页。,1、直接溶血空斑试验,第四十六页，共七十五页。,2、间接溶血空斑试验,第四十七页，共七十五页。,3、SPA-SRBC溶血空斑试验,第四十八页，共七十五页。,1、细胞吞噬功能试验2、细胞杀菌功能试验,细胞吞噬与杀伤功能试验,第四十九页，共七十五页。,第五十页，共七十五页。,吞噬百分率=,吞有颗粒的吞噬细胞数,计数的吞噬细胞数,吞噬指数=,吞噬细胞吞噬的总颗粒数,计数的吞噬细胞数,第五十一页，共七十五页。,NBT复原试验,原理：,N-N-C+H+N=N-R-,N-NH2C N=NH,四氮唑基淡黄色,甲月簪基紫黑色,第五十二页，共七十五页。,NBT复原试验,方法：,1、抗凝血+硝基蓝四氮唑NBT，37。C孵育25min。2、推片染色、镜检。,正常值：,NBT阳性细胞 7.5-15%,第五十三页，共七十五页。,第四节 免疫细胞凋亡测定,一、细胞凋亡的概念与原理二、细胞凋亡的检测方法,第五十四页，共七十五页。,一、细胞凋亡的概念与原理,1、细胞凋亡的概念2、细胞凋亡的原理3、细胞凋亡的特点,第五十五页，共七十五页。,1、细胞凋亡apoptosis,细胞在内源性基因调