免疫原和抗血清的制备概要(1).pptx

免疫原和抗血清的制备,第一页，共四十九页。,第一节免疫原的制备,免疫原是能够引起机体产生抗体，并能与之发生反响的物质一、颗粒性抗原的制备：1.颗粒抗原指细胞抗原或细菌抗原。2.细菌抗原：H抗原有动力的菌株O抗原 1002-2.5h为了 破坏H抗原，获得O抗原Vi抗原3.虫卵、细胞膜颗粒抗原呈乳浊状，多用V内免疫，较少用佐剂作皮内注射,第二页，共四十九页。,二、可溶性抗原的制备：,组织和细胞粗抗原的制备：1.组织和细胞混合抗原的制备：组织匀浆制备：标本要求：新鲜或低温-40保存的去除外表包膜或结缔组织或一些大血管，脏器应进行灌注，除去血管内残留血液 制备处理好组织0.05NaN3生理盐水洗净剪成小块粉碎高速组织捣碎机法2000-3000rpm离心10min研磨法：玻璃匀浆器,乳钵研磨上清10000-20000rpm 20-30min高速离心,第三页，共四十九页。,2.细胞抗原的制备：,细胞抗原细胞膜蛋白抗原细胞浆抗原细胞核及核膜抗原粉碎：1反复冻融法2冷热交替法：适合细菌，病毒蛋白质及核酸3超声破碎法：适合于微生物和组织细胞 细菌，尤其真菌厚膜孢子难破坏4自溶法：利用组织和微生物的自身酶系需一定PH和温度动物组织cell0-4微生物室温5溶菌酶法：一定PHPH8.0，溶菌酶可专一破坏菌胞。蜗牛酶，纤维素酶消化细菌和组织cell6外表活性剂处理法,第四页，共四十九页。,蛋白质抗原的制备和纯化：,可溶性抗原绝大局部为蛋白质1.超速离心和梯度密度离心法：用来别离亚细胞局部及大分子蛋白质1差速离心：上下速交替进行。将大分子物质别离2梯度密度离心：区带别离法，通过梯度密度来维持重力的稳定性，通常别离的悬液中的颗粒比液体重，要使之上浮，必须参加第三种成份，其密度连续或不连续升高，即所谓梯度3第三种成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化铷适合于少局部大分子抗原，对于大量的中、小分子量的蛋白质抗原不适用此法,第五页，共四十九页。,2.选择性沉淀法：,用沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀1核酸除去法：1提取沉淀剂：2核糖核酸酶降解法：用DNA或RNA酶与提取液作用30-60min4，即可除去核酸2盐析沉淀法：1抗原的粗筛33-50饱和度的硫酸铵2提取丙种球蛋白主要为IgG33-40饱和度的硫酸铵3抗原的浓缩3有机溶剂沉淀法：有机溶剂多为酒精和丙酮4水溶性非离子型聚合物沉淀法：PEG+蛋白质颗粒沉淀、复合物、蛋白质发生水的重分配分子量2000-6000PEG可用于沉淀蛋白PEG浓度不同可沉淀不同pro3-4沉淀免疫复合物6-7沉淀IgM8-12沉淀IgG12-15%沉淀其他球蛋白25沉淀白蛋白,第六页，共四十九页。,3.凝胶过滤和离子交换层析：,1分析筛层析又名凝胶过滤，将Ag分成大、中、小三种大分子较快出来，小分子因被阻留，出来较慢。根据分子量不同 2离子交换层析：离用带离子基因的纤维素流动相逐步增加离子强度，蛋白质按电荷不同或量的差异分组常用DEAE纤维素二乙基氨基乙基纤维素根据pro携带电荷不同溶液中等电点不同常用于别离IgM因为IgM分子量大凝胶过滤洗脱曲线,第七页，共四十九页。,4.亲和层析：,利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间的具有的专一性亲和力而设计的层析技术。eg：Ag和Ab，酶和酶的抑制剂，酶蛋白和辅酶，激素和激素受体等其之间有特殊亲和力，可紧密结合成复合物.1亲和层析支持物的选择：常用：琼脂糖珠Sepharose 2B、4B、6B,第八页，共四十九页。,2配体的选择：3抗原或抗体与支持物的结合：步骤：1活化支持物上的功能基因溴化氛PH11与支持物上的羟基形成氨基形成氨基甲酸酯基因2交联联接3清洗：除去未结合的pro4亲和层析条件的选择：原理：一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变如稀酸、稀碱、浓盐、加温等时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上能从液相中专一性分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原或抗体用化学方法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清或抗原按层析方法参加柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的PH值和离子强度，那么可以使抗体和偶联在载体上的Ag解离参加解脱剂，经洗脱，从而得到纯化的Ab。,第九页，共四十九页。,2配体的选择：,抗原或抗体与支持物的结合：步骤：1活化支持物上的功能基团溴化氰PH11与支持物上的羟基形成氨基甲酸酯基团2交联联接3清洗：除去未结合的pro 4亲和层析条件的选择：原理：在一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变如稀酸、稀碱、浓盐、加温等时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上就能从液相中专一性地分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原或抗体用化学方法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清或抗原按层析方法参加柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的PH值和离子强度，那么可以使抗体和偶联在载体上的Ag解离参加解脱剂，经洗脱，从而得到纯化的Ab。,第十页，共四十九页。,以免疫亲和层析为例三免疫球蛋白片段的制备：,1温和 别离亚单位：1改变PH值PH3或10，Ig亚单位自动解离2利用强度性剂适合载脂蛋白Ag和胶原肽的提取2二硫键的解离：适合于将轻、重链分开3溴化氰裂解法：与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反响，生成溴化亚氨内酯4酶法裂解：木瓜酶将IgG分解为Fc和Fab2三个片段胃蛋白酶IgG分解为Fab2和几个小肽段胰蛋白酶 IgG切成不规那么肽链 应用：木瓜酶切断，得Fc段，制备抗重链血清胃蛋白酶切取，得Fab2，用于诊断用Ab鉴别Ag,第十一页，共四十九页。,四纯化抗原的鉴定：,1.含量鉴定：生化方法酚试剂法双缩脲法可见光吸收法 紫外吸收法Ag珍贵，少2纯度的鉴定：醋酸纤维薄膜电泳法 经典常用聚丙烯酰胺凝胶电泳法 免疫电泳法 免疫双扩散法 ELISA或RIA放免不纯，也可能是同一物质的聚合体或降解物较纯，也不能排除在这条带中有其他成分所以单一方法，可信度差。因而几种方法联用较可靠,第十二页，共四十九页。,三、半抗原免疫原的制备,半抗原：只有反响原性，没有免疫原性的小分子物质半抗原+载体大分子物质-Ab人工抗原结合方法物理法：利用电荷和微孔化学法一载体的选择：1.蛋白质：常用牛血清白蛋白2.多肽类聚合物：常用多聚赖aa3.大分子的聚合物和某些颗粒：参加福氏佐剂可产生良好Ab二联接的方法：三个根本条件：1.碳化二亚胺法;2.二醛法：3.混合酸酐法氯甲酸异丁酯法三无羧基和氨基半抗原衍生物的制备：1.琥珀酸酐法2.O-羧甲基羟胺法3.一氯醋酸钠法，适用于带酚基的半抗原4.重氮化的对氨基苯甲酸法：适于带酚基的半抗原,第十三页，共四十九页。,四.佐剂：,一使用佐剂的目的为提高免疫原性佐剂本身可有或无免疫原性二机理：1.可直接或参与cell免疫反响2.佐剂与Ag混合，可以使Ag在局部组织的存留时间长，延长Ag的局部吸收。可持续刺激机体，产生高滴度Ab3.佐剂可增加Ag外表积，并改变Ag的活性基因构型，从而增加Ag的免疫原性。,第十四页，共四十九页。,常用的佐剂和制备方法：,1.应用最多的为福氏佐剂不完全：石蜡油+羊毛脂完全：石蜡油+羊毛脂+卡介苗2.乳剂的制备：乳剂：Ag和佐剂的混合物Ag与佐剂比例为1：1，注射前要充分乳化乳化方法研磨法搅拌混合法 旋涡混合,第十五页，共四十九页。,抗体的制备,多克隆抗体的制备单克隆抗体的制备,第十六页，共四十九页。,第二节抗血清的制备,免疫原+佐剂刺冲动物机体获得抗血清一.动物的选择1.种属差异越远越好，太近不易产生良好的抗体，甚至不产生2.抗血清量的要求：量大，选大动物 量少，选小动物3.抗血清的要求：R型兔型 H型马型4.抗原的选择：蛋白质Ag大局部动物皆适合，常用家兔、山羊IgE对绵羊，胰岛素对家兔，酶对山羊免疫时不产生Ab5.甾体激素多用兔，酶多用豚鼠6.对动物个体的要求：雄性 稚龄、健康、正常、无感染,第十七页，共四十九页。,二、免疫前准备,1.正常饲养：3d，观察是否健康、正常、无感染2.取阴性血清：耳静脉取血,第十八页，共四十九页。,二、免疫剂量、时间和途径选择原那么：,1.剂量：大动物0.5-1mg/只 小动物0.1-0.6mg/只1免疫剂量不要过大，Ag过量，易产生免疫抑制2第一次免疫剂量要小，屡次免疫后可加大剂量3选择适宜的免疫剂量，要根据Ag性强弱，分子量大 小，动物大小，免疫时间而定。2.时间：1间隔时间短，易产生免疫抑制一般第1、2次间要有10-20d，2次以后7-10d2半抗原间隔时间长 3.途径：多点注射，足掌、腋窝L结周围，背部两侧，颌下，耳 后皮内或皮下注射Ag珍贵，采取微量注射法,第十九页，共四十九页。,免疫程序：,1.背部皮下多点注射2.淋巴结内注射,第二十页，共四十九页。,试血,1.根据免疫程序末次免疫，从耳静脉取血别离血清2.琼脂双扩散测效价,第二十一页，共四十九页。,三.动物采血法：,抗血清鉴定采血前，禁食动物24h，防止血脂过高末次免疫后，5-7d之内采血。否那么抗血清效价1.颈动脉放血法：适于兔、羊2.心脏采血法：适于小动物3.静脉屡次采血清免：耳中央V100ML 羊：颈V1500-2000ML 小鼠：断尾或摘除眼球2ML抗血清别离，灭活5630min,第二十二页，共四十九页。,第三节抗血清的鉴定和保存,一、抗血清的鉴定：免疫成功，Ab较纯，含有杂Ab 免疫不成功1.特异性鉴定：免疫双扩散法2.效价的鉴定：免疫双扩散法Ab稀释法：不稀释 1/21/41/81/16 1/321/64Ag 1/32作为Ag效价3.AgAb的亲和力的鉴定Ag+Ab AgAb K值109-1011L/mol之间K值大，AgAb结合力大K值小，AgAb结合力小,第二十三页，共四十九页。,二、抗血清其他鉴定方法：,三、抗血清的保存：1.4无菌处理，防腐液体状态3-6月2.-20-40度冰冻保存5年小包装3.枯燥冰冻5-10年,第二十四页，共四十九页。,第四节抗血清中抗体的纯化,目的：除去杂Ab1.Ab特异性的纯化除去杂Ab 1吸附剂法 2亲和层析2.特异性IgG抗体的制备：1盐析法粗提V球蛋白不同饱和度的NH42SO4或Na2SO4 2离子交换层析法提取IgG：常用DEAE纤维素IgG带正电荷，其他pro带负电荷 3亲和层析法提取特异性IgG 4酶解法制备Fab2片段,第二十五页，共四十九页。,第五节 单克隆抗体及基因工程抗体,一、单克隆抗体：1、淋巴细胞杂交瘤技术 2、单克隆抗体 3、单克隆与多克隆抗体比较 4、用途二、基因工程抗体,第二十六页，共四十九页。,一、单克隆抗体,1、淋巴细胞杂交瘤技术(kohler milstein)淋巴细胞杂交瘤技术：75年才创立的技术，将在体外不能长期生存的免疫细胞与在体外能迅速增殖的骨髓瘤细胞在聚乙二醇的作用下融合产生杂交瘤细胞，所得杂交瘤细胞继承了两种细胞的能力，即保存了瘤细胞在体外迅速增殖传代的能力，又继承了免疫细胞合成与分化的能力，淋巴细胞主要 T细胞、B细胞(T细胞与胸腺瘤细胞融合，可产生分泌淋巴因子的T细胞杂交瘤)B细胞与 瘤细胞融合，产生能分泌特异抗体的B细胞杂交瘤。,第二十七页，共四十九页。,2、单克隆抗体：,通过淋巴细胞杂交瘤技术，把产生特定抗体的B细胞与能无限生长的骨髓瘤的细胞融合，形成的B细胞杂交瘤，由这克隆化B的 杂交瘤所产生的抗体。纯度高，专一性强，重复性好，且能持续在动物体外或体内产生固体性抗体。,第二十八页，共四十九页。,3、单、多克隆抗体比较：,多克隆抗体：是由多个淋巴细胞克隆产生的(抗原分子量大，外表决定簇多产生不 抗体)是高度异质性，特异性低，纯度差，反响不够灵敏，限制免疫学血清学的开展，影响诊断准确性和治疗效果。单克隆抗体：特异性强，体外 产生，质地均一，反响灵敏，工业化生产任何多肽蛋白质特别是半抗原均可用淋巴细胞杂交瘤技术来制备单克隆抗体。,第二十九页，共四十九页。,第三十页，共四十九页。,4、单克