2022年医学专题—细胞培养1(1).ppt

郎朗E-mail:,组织(zzh)和细胞培养技术,第一页，共六十页。,参考书目：组织(zzh)和细胞培养技术主编：章静波人肿瘤细胞培养主编:R.弗雷纳 R.I.弗雷谢尼细胞培养主编：司徒镇强 吴军正,第二页，共六十页。,第一章 引 论,一、组织培养的诞生与发展简史1886，His 提出原始的胚胎神经元或成神经细胞的细胞质向外突起而形成轴突，不断延伸，直至其前端与周围感觉器官或肌肉(jru)纤维接触为止。1890，Cajal 应用胚胎神经组织切片的银渍染色技术研究神经元的发生，结果支持了His的学说。,第三页，共六十页。,反对His和Cajal的学者 坚持(jinch)“细胞链”的理论，从成神经细胞到某种受神经支配的周围组织之间有许多分散的细胞，这些连贯的链细胞融合便形成了轴突。1907，Harrison 悬滴培养法，取蛙胚一片组织，采用成洼淋巴做培养基，能存活一周。1910，Burrows 用鸡血浆作为鸡胚组织的支持和营养物质。比淋巴好，能使神经组织、心脏组织及皮肤生长良好。,第四页，共六十页。,Burrows和Carrel 成功培养了成年狗、猫、小鼠、豚鼠以至恶性组织的外植物。此外，证明传代可延长细胞的寿命。同时，若把胚胎提取液与血浆混合使用，存活的更好。Carrel（外科大夫）发明(fmng)卡式培养瓶W.H.Lewis和M.R.Lewis 发展出许多合成培养基1929，Fell 组织培养我国始于20世纪30年代,第五页，共六十页。,第六页，共六十页。,卵细胞的形成(xngchng)过程,第七页，共六十页。,21三体综合征先天愚型 21-三体综合症的病因为染色体数目异常，患者比正常人多一条21号染色体。其多余(duy)的染色体80%来自母亲，20%来自父亲。随着母亲年龄升高，发病的风险增大。据估计我国目前大约有60万以上的21三体综合症患儿，按目前的出生率我国平均20分钟就有一例21三体综合症患儿出生，全国每年出生的唐氏综合症患儿将达27000例左右。苏联遗传学家达拉森科和鲁夏诺娃对一些科学家的意见作了归纳：一些人如斯特尔等认为，这是内分泌紊乱造成的，特别在一些年龄偏大的妇女中；另一些人的假说认为，主发是药物、食物和饮水中的化学物质，引起了生殖细胞中染色体的异常。他们发现，在美国中部21三体综合症的发生率与水中氟的浓度有关。,第八页，共六十页。,头颅小而圆，枕部平，脸圆，鼻扁平，睑裂细且向外上倾斜，眼距过宽，内眦赘皮明显，睫毛短而稀疏(xsh)，常有斜视。虹膜时有白斑，常有晶体混浊。嘴小唇厚，舌大常外伸，耳小，低位耳，耳廓畸形。头发直而不卷曲。颈背部短而宽，有过剩的皮肤。患者的平均寿命只有16.2岁。50的患儿在5岁前即死亡。只有8的患者活过40岁，2.6活过50岁。患者的寿命通常取决于有无严重的先天性心脏病和消化管畸形以及抗感染能力的降低程度。,第九页，共六十页。,二、组织培养常用(chn yn)术语1.Cell culture(细胞培养):单个细胞在体外条件下的生长。2.Cell line(细胞系):原代培养物经首次传代成功后即成。3.Cell strain(细胞株):具有某些特征与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系，这些特征或标志在尔后的培养中必须保持下去。4.Cell cycle(细胞周期):细胞从前一次分裂结束至本次分裂结束所经历的时相。,第十页，共六十页。,5.Clone(克隆):单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，他们的遗传特性相同。6.Contact inhibition(接触抑制):体外培养的贴壁细胞，相互接触时，便停止了分裂增殖。7.Primary culture(原代培养):直接取自生物体细胞、组织或器官(qgun)开始的培养。8.Seeding efficiency(贴壁率):在一定时间内，接种细胞贴附于培养皿表面的百分率。,第十一页，共六十页。,9.Sub-culture(传代培养):在体外培养条件下，将细胞从一个培养皿移至另一个培养皿。10.Suspension culture(悬浮培养):细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖的一种培养方式。11.Tissue culture(组织培养):组织(zzh)在体外条件下保存或生长。12.Apoptosis(细胞凋亡):细胞内死亡程序的开启而导致细胞自杀的过程，常称为程序性细胞死亡。,第十二页，共六十页。,第二章 细胞培养的设备(shbi)条件,一、细胞培养中常用的仪器设备1.无菌室：密闭性；通风透气良好；便于消毒；方便进出2.超净工作台:使无菌空气以微流(0.32-0.48米/秒)方式，从工作台内流向工作台外。3.纯水器：18.2M,254.压力(yl)蒸气消毒器:玻璃器皿(121,30min),塑料（115,15min),第十三页，共六十页。,5.电热恒温(hngwn)干燥箱:平衡培养的器材、试剂的温度。6.CO2培养箱：5%CO2,37,70%酒精消毒内腔，加入无菌水，保证湿度，加入CuSO4,预防霉菌。7.恒温水浴锅：与细胞接触的液体要求保存与于4或-20，使用时，须预热。8.液氮罐：常用35和50立升两种，一般一周充一次，液氮温度达-196。,第十四页，共六十页。,9.倒置显微镜：观察细胞生长状态10.离心机：在分离、传代和处理培养的细胞时，常用离心的方法收集细胞。11.无菌过滤器：Zeiss滤器(lq)(不锈钢)，玻璃滤器及微孔滤膜滤器。12.洗刷装置13.细胞计数板和电子细胞计数仪,第十五页，共六十页。,CO2培养箱设定的条件为37，5CO2。使用CO2培养箱培养细胞(xbo)时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。,CO2培养箱,第十六页，共六十页。,干燥箱,水浴锅,第十七页，共六十页。,滤器(lq),纯水仪,第十八页，共六十页。,第十九页，共六十页。,液氮罐,离心机,第二十页，共六十页。,酶标仪 微孔(wi kn)板震荡器,第二十一页，共六十页。,第二十二页，共六十页。,二、细胞培养的无菌环境1.无菌室：相对(xingdu)的密闭、防尘、防菌1.1 无菌室的结构1.2 无菌室的消毒和防污染：每日使用前紫外线照射(1-2h),每周甲醛、乳酸或过氧乙酸熏蒸(2h),每月新洁儿灭擦拭地面和墙壁。2.超净工作台2.1 原理2.2 使用和保养：使用前开启紫外灯照射10-30min。然后让超净工作台预工作10-15min，以去除臭氧和使台面空间呈净化状态，使用完毕，用70%酒精擦拭干净。,第二十三页，共六十页。,第二十四页，共六十页。,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动(q dn)空气通过高效滤器除去空气中的微生物，使空气得到净化，并使无菌空气以微流（0.32-0.48米/秒）方式，从工作台的工作空间流向工作空间以外，保证工作空间的绝对“无菌”。,超净工作台,第二十五页，共六十页。,三、常用(chn yn)的培养器皿,1.玻璃器皿：,玻璃瓶,培养(piyng)瓶,第二十六页，共六十页。,培养皿,移液管,离心管,第二十七页，共六十页。,2.塑料(slio)器皿,培养(piyng)瓶,第二十八页，共六十页。,培 养 板,第二十九页，共六十页。,一次性滤头,滤头,第三十页，共六十页。,微量离心管（Eppendorf管）,第三十一页，共六十页。,四、培养(piyng)器皿的清洗与消毒,1.玻璃器皿的清洗1.1 浸泡1.2 刷洗1.3 浸酸1.4 冲洗成分 弱清洁液 次强酸清洁液 强酸清洁液重铬酸钾(zhn sun ji)(g)100 120 63硫酸(ml)100 200 1000蒸馏水(ml)1000 1000 200,第三十二页，共六十页。,2.橡胶制品的清洗新购置的橡胶制品（胶塞，胶管、橡皮乳头）的洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟 0.5mol/L HCl煮沸15分钟 流水冲洗 自来水煮沸2次 蒸馏水煮沸20分钟 50烤干备用用过的胶塞：基本同玻璃器皿，但洗刷的重点是使用(shyng)面，应逐个刷洗，单蒸、双蒸冲洗后，用双蒸煮沸30分钟。,第三十三页，共六十页。,3.塑料制品的清洗塑料制品的特点：质地软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。清洗程序：流水冲洗，浸泡，纱布或棉签刷洗，冲洗，晾干，浸于清洁液中15min，冲洗，凉干备用。4.包装常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃(b l)或金属的消毒筒。,第三十四页，共六十页。,4.消毒(xio d)和灭菌4.1 紫外线消毒(xio d)紫外线是一种低能量的电磁辐射，革兰阴性菌最为敏感，其次是革兰阳性菌，再次为芽孢。直接作用机制：破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活间接作用机制：紫外线照射产生的臭氧杀死微生物4.2 电离辐射灭菌：是以放射性核素产生的射线或电子加速器产生的加速离子辐照物品以杀死微生物的方法。,第三十五页，共六十页。,4.3 高温湿热灭菌：压力蒸汽灭菌，造成蛋白质变性凝固使微生物死亡。玻璃类灭菌（121，30分钟）；橡胶、塑料类（115，15分钟）消毒(xio d)好的物品，应立即放到60-70烤箱内烘干备用煮沸消毒也是常用的方法4.4 高温干热灭菌：电烤箱的物品加热到160以上，并保持90-120分钟，达到灭菌目的。灼烧也是干热灭菌的方法之一。4.5 过滤除菌：微孔膜过滤,第三十六页，共六十页。,4.6 甲醛：其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用，用于无菌室的空气和物体表面的灭菌。(1)多聚甲醛加热法：10-20g/m2,作用12-24h(2)甲醛水溶液蒸发法:25ml/m2，时间同(3)氧化法:福尔马林40ml/m2,高锰酸钾30g/m2(漂白粉20g/m2)。4.7 环氧乙烷：消毒塑料用品、不耐高热高压以及不能受潮湿(chosh)的物品，环氧乙烷易燃易爆，且气体有毒，不可用于空气消毒。,第三十七页，共六十页。,4.8 乙醇：对其他(qt)灭菌剂有增效或协同作用，如：戊二醛、碘伏、氯已定（洗必泰）。消毒浓度为70%-75%的乙醇水溶液。4.9 氯乙定：主要用于皮肤及创面消毒。用0.02%洗必泰和0.5%洗必泰乙醇溶液(70%乙醇配制)消毒手及动物创面的洗涤消毒。4.10 戊二醛:现将戊二醛原液稀释成2%水溶液，再加入0.3%NaHCO3,将溶液调至Ph7.5-8.5，另加入0.5%亚硝酸钠可防锈和增效。,第三十八页，共六十页。,4.11 新洁而灭：0.1%水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒(xio d)。4.12 碘伏和碘酊：医用碘伏是聚烯吡咯烷酮-碘，可用于手消毒(xio d)和手术野的皮肤消毒(xio d)。也可将1%碘伏用于地面、台面及物品表面等的擦拭或喷雾消毒(xio d)。碘酊又名碘酒，主要用于皮肤消毒，皮肤经碘酒涂抹2-3次后，须用70%乙醇脱碘。,第三十九页，共六十页。,第三章 组织(zzh)培养基,一、培养基的基本要求1.营养成分：氨基酸、单糖、维生素、无机离子和微量元素2.促生长因子及激素：各种激素、生长调节因子对于维持细胞的功能(gngnng)、保持细胞的状态（分化的或未分化的）具有十分重要的作用。3.渗透压：人血浆渗透压约290mOsm/kg，是培养人体细胞的理想渗透压。大多数哺乳类动物细胞，渗透压在260-320 mOsm/kg的范围内都适宜。,第四十页，共六十页。,4.pH:适宜pH为7.2-7.4，合成培养基中使用了NaHCO3-CO2缓冲系统，并采用开放式培养的方式，使细胞代谢产生的CO2及时(jsh)逸出培养皿，再通过稳定调节温箱中CO2气体的浓度（5%），使之与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。NaHCO3+H2O Na+HO-+H2O+CO25.无毒、无污染：培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染。,第四十一页，共六十页。,二、天然(tinrn)培养基,1.血清1.1 血清的种类：主要是牛血清，分