无乳支原体PCR检测方法 GBT 34728-2017.pdf

GB/T34728-20176.3.5培养物样品的处理分离的疑似Maga培养物取1mL,4、13000r/min离心10min后，弃上清，收集沉淀。6.3.6阴、阳性对照的处理阴、阳性对照样品各1mL,4、13000r/min离心10min后，弃上清，收集沉淀。6.4样品DNA的提取用适宜的基因组DNA提取试剂盒，按照说明书提取样品基因组DNA,提取物最终体积为50L。DNA提取操作应在通风柜中进行。6.5PCR反应6.5.1反应体系按下列方法配制50L反应体系：DNA模板5 uL2XPCR反应液252L上游引物1L下游引物1 gL灭菌去离子水18L每次反应设阴、阳性样品对照和空白对照，阴性样品对照用Mag培养基提取的DNA作为模板，阳性对照用Maga灭活培养物提取的DNA作为模板，空白对照用灭菌去离子水作为模板。6.5.2反应扩增程序加样后，置于PCR扩增仪进行反应，反应条件如下：955mi进行PCR预变性，然后进行35个循环的扩增(9430s,5030s,7260s),最后72延伸10min,4保存。6.6电泳观察取PCR产物各5L(包括被检样品，阴、阳性对照样品、阳性质粒对照和空白对照)，分别和1L6PCR上样缓冲液混合均匀后，连同DNA分子质量标淮在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统中观察结果（参见附录C)。7结果判定7.1实验成立的条件电泳观察显示，阳性对照有1624bp的特异性扩增条带，阴性和空白对照没有相应条带，则试验成立。7.2实验结果判定符合7.1的条件，样品出现1624bp的特异性扩增条带判为PCR结果阳性，表述为检出无乳支原体核酸。样品无特异性的阳性扩增条带判为PCR结果阴性，表述为未检出无乳支原体核酸。