饲料中赭曲霉毒素A的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法 GBT 30957-2014.pdf

GB/T30957-2014饲料中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法1范围本标准规定了饲料中情曲霉毒素A的免疫亲和柱净化-高效液相色谱划定方法。本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料中褚曲霉毒素A的测定。本标准定量限为5.0g/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备3原理试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有赭曲霉毒素A特异抗体的免疫亲和层析柱层析净化，用PBS缓冲液和纯水清洗，甲醇洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪测定情由霉毒素A的含量。4试剂除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂，用水符合GB/T6682中二级用水的规定。4.1甲醇：色谱级。4.2乙睛：色谱级，4.3氯化钠。4.4磷酸氢二纳。4.5磷酸二氢钾。4.6須化御。4.7盐酸。4.8碳酸氢钠。4.9吐温-20(Tweem-20).4.10乙酸。4.11清洗缓冲液：将25g瓶化钠(4.3)，5g碳酸氢纳(4.8)溶于水中，加入0.1mL吐温-20(4.9)，加水稀释至1L。4.12PBS缓冲液：称取8.0g氣化钠(4.3)、1.2g磷酸氢二钠(4.4)、0,2g磷酸二氢钾(4.5)、0.2g氧化钾(4.6)溶于900mL水中，用浓盐酸(4.7)调节pH值至7.0，用水定容为1L,GB/T3095720144.13提取液：甲醇+水(8+2)：将800mL甲醇(4.1)与200mL水混合均匀。4.14HPLC流动相：量取495mL乙腈(4.2)至1000mL的容量瓶中，加人10mL乙酸(4.10)，用水定容至1000mL。混合均匀并通过0.45m滤膜，备用。4.15赭曲霉毒素A(Ochratoxin A)标准品：纯度99%。4.16赭曲霉毒素A标准储备液：准确称取适量的赭曲霉毒素A标准品，用甲醇配成浓度为0.1mg/mL的标准储备液，一20冰箱中贮存，可使用12个月。4.17赭曲霉毒素A标准中间液(5.0g/mL):准确移取5.0mL赭曲霉毒素A标准储备液(4.16)于100mL容量瓶中，用甲醇(4.1)稀释并定容至刻度。该溶液保存于2一8冰箱里，可使用3个月。4.18赭曲霉毒素A标准工作液：赭曲霉毒素A标准中间液(4.17)用流动相(4.14)稀释，配制0.5g/L、2.5g九、10g/L、50g/L、100g/L浓度的赭曲霉毒素A标淮工作液。赭曲霉毒素A标准工作液储藏在28冰箱里，可使用7天。5仪器和设备除实验室常用设备外，还需要以下仪器和设备：5.1免疫亲和柱，容量0.1g赭曲霉毒素A,回收率85%。5.2振荡器。5.3氨吹仪。5.4高速均质器：18000r/min22000r/min。5.5高效液相色谱，配有荧光检测器。5.6真空装置或空气压力泵，符合免疫亲和柱的要求。5.7玻璃纤维滤纸，直径21mm、125mm,无荧光特性。6试样的制备按GB/T14699.1采集有代表性的样品，按GB/T20195进行样品制备。粉碎过1mm孔筛，混合均匀，装入密闭容器，低温保存备用，7分析步骤7.1样品处理7.1.1提取准确称取粉碎试样25.0g(精确到0.1g)于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氧化钠，加入100mL提取液(4.13)。将搅拌杯置于均质器(5.4)上，高速搅拌提取2min,或振荡器(5.2)振荡60min。提取液经定性快速滤纸过滤于干净的烧杯中。准确移取5.0mL滤液并加入45.0 nL PBS缓冲液(4.12)稀释，混合均匀，经玻璃纤维滤纸(5.7)过滤至澄清后，随即进行免疫亲和柱净化操作。7.1.2净化将免疫亲和柱(5.1)连接于10mL玻璃定量管下。准确移取10.，0mL样品提取液于玻璃定量管中，调节压力使溶液以不超过2mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至3mL以上空气通过柱体。分别以10mL清洗缓冲液(4.11)、10mL水清洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使3mL以上空气通过免疫亲和柱。准确加入1.5mL甲醇(4.1)洗脱，流速不超过1mL/min,收集洗脱液于玻璃试管中，加入2