辣椒细菌性斑点病菌检疫鉴定方法 GBT 36851-2018.pdf

GB/T368512018见附录C和附录D。5检疫鉴定方法5.1症状检查参照附录A中的症状描，重点检查植株的叶片及果实等部位是否具有辣椒细菌性斑点病的疑似症状。病害的典型症状是：番茄果实表面产生软木塞状斑点或疮痂，边缘水渍状，卵形或不规则，辣根果实上很少产生症状，但早期感染可引起落果，番茄和辣椒叶片上，病痕出现不规则水渍状，初为绿色，后逐渐变成褐色并坏死，详见附录A病害症状捕述。注意与番茄叶斑病菌(Pseudor1oa5 syringae pv.omato)引起的症状区别，后者引起的斑点明显小，并且病斑后期有明显的黄色朵圈。对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状的植株送实验室进行检测鉴定，田间无症状植株可随机采样。5.2样品制备5.2.1植株样品对于有症状样品，低倍显微镜下观察病健交界处组织有无澄菌现象，若有益菌现象，选取新鲜组织(叶片或果实)上的病健交界处（对于无症状样品，随机选取植物组织），在75%乙醇或含有效氣1%的次氣酸钠溶液中表面消毒50s60s,无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养皿中，加5滴10滴无菌水，用灭菌摄子或剪刀将病组织捣碎，静置5min10min,即制成组织悬浮液，用于分离培养及分子生物学检测。5.2.2种子样品对于种子样品，取2000粒种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）倒人无菌的三角瓶或其他容器内，加入适量0.05mol/L磷酸吐温缓冲液，使种子完全浸没，轻轻摇晃20s30s混匀，在4下浸泡过夜。将浸泡液1000r/min离心1min,去沉淀，上清液10000r/min离心10min,弃上清液，取沉淀，用无菌水悬浮，制成1mL2mL样品悬浮液，用于分高培养及分子生物学检测。5.3分子生物学检测5.3.1模板制备对于植株或种子样品，按照5.2的方法制备成样品悬浮液后，直接用商业化植物基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明提取样品总DNA,一20保存备用，对于分离培养得到的疑似菌株，可直接或经裂解处理后(97沸水浴10min:12000r/min离心10min,取上清液，一20保存)作为分子生物学检测的DNA模板。根据实验室条件，可选择下列任一方法(5.3.2或5.3.3)进行检测。5.3.2PCR凝胶电泳检测对于种子、植株等样品，以已知带菌的辣椒种子或植物组织作阳性对照（若无已知带菌材料，可用模拟带菌方式代替)，以健康的辣根种子或植物组织作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测。对于纯培养菌株，以X.vesicatoria标准菌株作阳性对照，用非X,vesicatoria的植物细菌作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行P凝胶电泳检测，具体检测步骤见附录C。