葡萄A病毒检疫鉴定方法 GBT 35332-2017.pdf

GB/T35332-2017见附录B:RT-PCR检测试剂见附录C:实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D:免疫电镜检测试剂见SN/T1840.6样品制备将葡萄种苗种植于隔离温室中，在生长期间进行严格的症状检查。对可疑症状的植株，采基部发育良好具症状的叶片1g单独制样，用于后续检测，无明显症状的，可5株混合采样用于后续检测。7检测鉴定7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)把制备的样品上清液加人已包被GVA抗休的称联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染GVA的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作为空白对照，其中阴性对照的种类和材料应尽量与检测样品相一致。具体操作见附录B。7.2免疫电镜检测免疫电镜检测方法见SN/T1840。7.3RT-PCR检测RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录C。7.4实时荧光RT-PCR检测实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成DNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录D。如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。8结果判定样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则测进行：采用DAS-ELISA或免疫电镜方法进行检测，若：一检测结果为阳性时：RT-PCR的检测结果为阳性，则判定样品携带GVA:或用实时荧光RT-PCR进行检测，若检测结果为阳性，则判定样品携带GVA。一检测结果为阴性时：RT-PCR的检测结果为阴性，则判定样品不携带GVA,检测结果为阳性，则对产物进行测序，测定的序列为GVA序列，则判定样品携带GVA;或用实时荧光RT-PCR进行检测，若检测结果为阴性，则判定样品不携带GVA,若检测结果为阳性，则判定样品携带GVA。