红霉素抑制PI3K_Akt...单核细胞炎性反应的效果研究_孙雪皎.pdf

论著基础研究 ：网络首发 ：（）红霉素抑制 通路增加 蛋白表达减轻烟草烟雾暴露下单核细胞炎性反应的效果研究孙雪皎，陈琳，陈慧，李程，蓝官引（柳州市人民医院呼吸与危重症医学科，广西柳州 ）摘要目的研究红霉素通过抑制 通路增加 蛋白表达从而减轻烟草烟雾暴露下单核细胞炎性反应的效果。方法以人单核细胞株（）为研究对象，采用烟草烟雾提取物（）制造细胞氧化应激模型，分为空白对照（）组、组（刺激细胞）、红霉素组（红霉素预孵育 刺激细胞）、抑制剂组（通路抑制剂 预孵育 刺激细胞）等组。根据转染 干扰细胞中 蛋白的表达，分为 对照组、组、红霉素组、组、组、红霉素组等组。采用逆转录聚合酶链式反应（）检测各组细胞中 、的表达。采用 检测各组细胞内 、核因子（）蛋白的水平。结果与空白对照组比较，组白细胞介素（）水平明显升高，及 蛋白的表达水平上升，蛋白及 的表达水平下降。红霉素组和抑制剂组 水平较 组下降，及 蛋白的表达水平下降，蛋白及 的表达水平有所升高。不同细胞氧化应激模型组 水平比较差异无统计学意义（）。组 的表达水平较 组明显降低，但与 组、红霉素组比较无明显差异；组 表达水平下降，而 红霉素组表达水平上升；组及 组 及 表达水平上升，但 红霉素组、红霉素组表达水平下降。组与 组 及 表达水平无明显差异。不同干扰组间 蛋白的表达水平无明显差异。结论红霉素可通过抑制 通路增加 蛋白的表达减轻烟草烟雾暴露下单核细胞的炎性反应。关键词红霉素；烟草烟雾提取物；单核细胞；蛋白；通路炎症 中图法分类号 文献标识码 文章编号 （），（，）（）（）（），（），：（），（），（），（），重庆医学 年月第 卷第期基金项目：广西壮族自治区自然科学基金（青年基金）项目（）；广西壮族自治区柳州市科技局科技计划项目（）。作者简介：孙雪皎（），主任医师，博士，主要从事慢性阻塞性肺疾病发病机制及治疗方面的研究。通信作者，：。（），（），（），（），（），；慢性阻塞性肺疾病（）是累及肺部及全身的慢性炎症性疾病，疾病呈进行性发展，严重的 致残率及致死率较高，会影响患者生活质量，给患者带来极大的心理负担及经济负担。烟草烟雾及环境污染等可引起氧化应激，导致氧化损伤，进而直接损伤气道上皮、加重气道的炎症反应，亦可导致蛋白酶抗蛋白酶失衡等，最终导致气流受限。患者脱离氧化应激环境后气流受限不能完全逆转，呈持续性的气流受限，这是导致 发生、发展的主要原因之一。红系衍生的核因子相关因子（）是具有调节抗氧化基因、维持细胞内氧化还原平衡、抑制凋亡及炎症等多种生物活性的关键转录因子，其与多种细胞因子相互关联，从而发挥多重保护作用。与氧化应激、炎症反应、呼吸系统疾病、恶性肿瘤、癌前病变 及 心 血 管 疾 病 等 的 发 生、发 展 有 着 密 切 的 联系。近年来，研究发现 在 的发生、发展中具有重要作用。有研究表明，信号通路激活 ，进而对抗氧化应激，维持氧化抗氧化平衡。然而，是否有药物可以通过作用于 进而改善 患者的炎症反应，国内外尚无类似研究。作者以此为切入点，以单核细胞株（细胞）为研究对象，观察红霉素是否能够通过作用于 蛋白的表达，减轻烟草烟雾暴露下单核细胞的炎症反应，同时验证在单核细胞炎症反应中，通路与 的关系，以及 是否受 通路的调控。本研究将为 的防治提供新的思路。材料与方法材料以人 细胞为研究对象，购于中国科学院细胞库。方法分组采用烟草烟雾提取物（）制造细胞氧化应激模型，分为以下组：空白对照组（），细胞培养液培养 细胞，不给予红霉素及 干预；组（），给予 刺激细胞过夜；红霉素组（），给予红霉素预孵育后予 刺激过夜；抑制剂组（），给予 抑制剂 预孵育后予 刺激过夜。根据转染 干扰细胞 蛋白表达方式，分为以下组：对照组（），采用细胞培养液培养，不给予红霉素及 干预；组（），给予 刺激细胞过夜；红霉素组（），给予红霉素预孵育 后予 刺激过夜；组（），应用脂质体法 转染 细胞，转染后的细胞应用细胞培养液培养；组（），转染后的细胞给予 刺激细胞过夜；红霉素组（），转染后的细胞给予红霉素预孵育后予 刺激过夜。细胞的培养 细胞为悬浮细胞，采用由 培养基及胎牛血清配置、含 胎牛血清的培养基培养，于二氧化碳培养箱、环境中温育。培养基存储。严格按照无菌操作，无菌台使用前打开紫外灯照射 ，各种所需的容器、枪头等物品必须经高压灭菌消毒后才能用于细胞培养。应用脂质体法 转染 细胞。给予 重庆医学 年月第 卷第期抑制剂 预孵育后予 刺激过夜。的刺激及红霉素、抑制剂的干预（）的制备与应用。将支去过滤嘴燃烧的香烟烟雾由注射器驱动装置连续抽吸，将烟雾缓慢通入 无血清的培养基中，制成悬液，放入密封瓶内，摇动使其充分溶解，应用紫外分光光度计（波长 ，吸光系数）测量烟草烟雾提取物的浓度。（）及红霉素的水平确定。应用 法确定试验中所应用的 及红霉素水平。（）红霉素及抑制剂的干预。红霉素组给予红霉素预孵育 后予 刺激过夜；抑制剂组、组应用细胞培养液代替红霉素，其余不变；空白对照组应用细胞培养液代替 及红霉素。经以上处理后，离心并获取上清液及细胞。各项指标的检测（）水平。采用酶联免疫吸附试验（，武汉华美生物工程有限公司）测定各组细胞上清液中 的浓度。（）、及核因子（）水平。采用逆转录聚合酶链式反应（）检测各组细胞中 、的表达。（）、蛋白水平。采用 检测各组细胞内 、蛋白的表达。统计学处理采用 统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析；计数资料以频数或百分比表示，组间比较采用检验。为差异有统计学意义。结果空白对照组、组、红霉素组、抑制剂组 水平比较与空白对照组比较，组 水平明显升高，红霉素 组、抑 制 组 水 平 较 组 下 降（）。见表。表不同细胞氧化应激模型组 浓度比较（，）组别浓度空白对照组 组 红霉素组 抑制剂组 ：，与空白对照组比较；：，与 组比较。不同细胞氧化应激模型组细胞中 、及 比较不同细胞氧化应激模型组细胞中 差异无统计学意义（）。组 表达较空白对照组下降，表达升高；红霉素组和抑制剂组 表达有所提高，表达降低。见图。：；：；：。图不同细胞氧化应激模型组细胞中 、及 比较不同细胞氧化应激模型组细胞中 、及 蛋白表达比较组细胞中 蛋白表达无明显差异。组 蛋白达较空白对照组下降，及 蛋白表达升高；红霉素组和抑制剂组 蛋白表达有所提高，及 蛋白表达降低，但两组间无明显差异。见图。不同干扰组中细胞 、及 蛋白表达比较 组 蛋白表达较 组明 显 降 低，但 与 组 及 红霉素组比较无明显差异；组的 蛋白表达较 组升高；组 蛋白表达较 组降低，而 红霉素组较 组表达升高；组与 组的 蛋白表达无差异，但 组、组表达均升高，而 红霉素组、红霉素组表达又再度降低。不同干扰组间 蛋白表达无明显差异。见图。重庆医学 年月第 卷第期 ：甘油醛磷酸脱氢酶，内参；：加入；：不加入。图不同细胞氧化应激模型组细胞中 、及 蛋白表达比较：加入；：不加入。图不同干扰组中细胞 、及 蛋白表达比较讨论 活化受蛋白磷酸化的调控。目前认为，丝裂原活化蛋白激酶（）、蛋白激酶（）等信号通路分子广泛参与了 的活化和核转位过程，诱导 核转位的信号通路类型与诱导剂、细胞种类等因素相关。有研究表明，信号通路激活是兔内毒素休克诱发急性肺损伤时机体的适应性调节机制。然而，在 炎症的发生与发展中，的表达如何受 通路调节尚不明确，是否有抗炎药物能够通过作用于 信号通路减轻 的炎症反应，国内外尚无相关研究。本研究结果表明，单核细胞经 刺激后炎症细胞因子水平提高，升高，通路关键蛋白 表达增加，表达下降；经红霉素干预后炎症反应减轻，表达下降，而 水平升高。应用 通路抑制剂 作为本研究的阳性对照，其与红霉素有同样的效果。烟草烟雾刺激后单核细胞炎症反应增加，与 通路激活、蛋白表达下降有关，红霉素及通路抑制剂均可抑制 通路活性，提高 蛋白的表达，进而减轻烟草烟雾暴露下单核细胞的炎症反应。为进一步证实 通路与 蛋白的关系，作者转染 干扰细胞中 蛋白的表达，应用 组作为对照，结果表明，组的 蛋白表达较 组升高，进一步证明 表 达 下降可 导致炎症反应增加；而两组的 蛋 白 表 达 无 差 异，证 明 的 变 化 不 影 响 通路活性。结合前述实验结果，证明 在 下游，受 通路的调控，红霉素可通过作用于 减轻烟草烟雾暴露导致的单核细胞炎症反应。国外有研究显示，系统的激活被认为是一种有效的细胞保护策略，可用于治疗不同的疾病，例如新型冠状病毒感染。此外，相关的研究显示，激活剂 通过激活 ，在对抗氧化应激和改善代谢方面显示出显著效果。在经 和脂多糖处理的 细胞中，通过激活 信号通路来调节 介导的 表达和抗氧化防御，以上两项研究可能在 的治疗方面提供潜在的靶点和新思路。紫杉醇可能通过刺激 信号通路来抑制苯并芘所致肺损伤的氧化应激和炎症反应。由此可见，的作用在近年来受到了广泛关注，值得进一步的研究与探索。综上所 述，信 号 通 路 活 性 及 其 下 游 蛋白的表达与烟草烟雾暴露的单核细胞炎症反应表达有关，红霉素能够抑制 通路活性，增加 蛋白表达，减轻炎症反应，这将为今后的研究及防治工作提供新思路及实验依据。参考文献 ，：，（）：，：，重庆医学 年月第 卷第期 ，：，（）：，（）：，：，（）：章静，史佳，余剑波，等 信号通路在兔内毒素休克诱发急性肺损伤中的作用 中华麻醉学杂志，（）：陈牡林，余剑波，宫丽荣，等 通路在内毒素休克兔肾损伤中的作用 中国病理生理杂志，（）：，：，：，：，：，：（收稿日期：修回日期：）（上接第 页），：，：，（）：艾秀清，王雪，唐成琼，等 乳腺癌保乳术后调强放射治疗不同配准方法摆位精度的临床研究癌症进展，（）：罗惠煌，童远，王永斌早期左侧乳腺癌术后锥形束 引导下 摆位误差致靶区及危及器官受照剂量中外医学研究，（）：，（）：加尔宝吐尔德，艾秀清，阿迪娜贾库林，等锥形束 引导下乳腺癌保留乳房术后调强放疗摆位误差临床分析 中华肿瘤防治杂志，（）：，（）：，：，：，：，（）：（收稿日期：修回日期：）重庆医学 年月第 卷第期