红胞藻藻红蛋白的分离纯化及稳定性研究_董硕.pdf

230 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期收稿日期：2022-10-15 *通信作者 基金项目：山东省自然科学基金联合基金项目(ZR2021LLZ003)；烟台大学研究生科研创新基金项目(GGIFYTU2224)。作者简介：董硕(1996)，女，山东烟台人，硕士研究生，研究方向为海洋生物活性。董 硕1，蒲 洋2，聂 岩1，薛欣然1，袁新雨1，李文军3，唐志红1*(1.烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005；2.鲁东大学农学院，山东 烟台 264000；3.中国科学院烟台海岸带研究所，山东 烟台 264003)摘要：文章旨在从红胞藻中分离纯化得到试剂级的藻红蛋白，并对其相关性质进行研究。以红胞藻为原料，采用反复冻融、硫酸铵盐析和疏水层析的方法分离纯化藻红蛋白，并对其稳定性进行研究。结果表明，红胞藻经过4次反复冻融后藻红蛋白溶出率最高，两步硫酸铵分级沉淀可使藻红蛋白纯度(A545/A280)提高到2.45，进一步采用Butyl-S-QZT 6FF疏水层析纯化后藻红蛋白纯度(A545/A280)达到试剂级，为6.63，回收率为48.9%。纯化的藻红蛋白在545 nm处有最大特征吸收峰，荧光激发峰位于541 nm和553 nm处，发射峰位于587.5 nm处，二级结构主要以-螺旋的形式存在。藻红蛋白含有3个亚基，分子质量分别为9、10 ku和20 ku，在3050、pH68条件下能保持相对稳定。Cu2+对藻红蛋白的光谱学性质有一定的影响，在Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+等离子存在时，藻红蛋白光谱学性质没有发生明显变化。结论：采用硫酸铵分级沉淀结合一步疏水层析获得了试剂级的藻红蛋白，得率高，工艺简便。研究结果为红胞藻藻红蛋白的大规模生产提供了参考。关键词：红胞藻；藻红蛋白；分离纯化；稳定性中图分类号：TS 201.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2023)04-0230-07Isolation,Purification and Stability of Phycoerythrin fromRhodomonas sp.DONG Shuo1,PU Yang2,NIE Yan1,XUE Xinran1,YUAN Xinyu1,LI Wenjun3,TANG Zhihong1*(1.College of Life Science,Yantai University,Yantai 264005,China;2.School of Agriculture,Ludong University,Yantai 264000,China;3.Yantai Institute of Coastal Zone Research,Chinese Academy of Sciences,Yantai 264003,China)Abstract:The purpose of this paper is to isolate and purify the reagent grade phycoerythrin from Rhodomonas sp.,and investigate its related properties.In this study,the phycoerythrin was separated and purified from Rhodomonas sp.by repeated freezing and thawing,ammonium sulfate salting out and hydrophobic chromatography,and its stability was studied.The results showed that the dissolution rate of phycoerythrin from Rhodomonas sp.was the highest after four repeated freeze-thaw cycles.The purity of 红胞藻藻红蛋白的分离纯化及稳定性研究DOI:10.13684/ki.spkj.2023.04.025 231 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期0 引言藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)是存在于多种藻类中的重要捕光色素蛋白，具有高荧光强度、抗氧化、高色度等优势，可广泛用于食品、化妆品、染料、药品等领域。藻红蛋白在不同领域应用时对其纯度(Amax/A280)要求不同，纯度大于0.7为食品级，大于3.0为医药级，大于3.9为反应级，大于4.0为试剂级。一般而言，藻胆蛋白的光谱学纯度(Amax/A280)越高，售价越高1-3。国内外已有较多关于藻红蛋白分离纯化的报道，其中主要以紫球藻、多管藻、红毛菜和紫菜作为提取原料。例如：徐远超4采用盐析、超滤及柱层析法相结合从紫球藻中纯化的藻红蛋白纯度达到5.213，但回收率只有39.2%。BENAVIDES J等5通过超声破碎和双水相萃取从紫球藻中分离纯化藻红蛋白，所得纯度为3.2。郭子叶等6采用多步硫酸铵盐析和2次羟基磷灰石层析分离纯化条斑紫菜，纯度达到4.5。张彬等7采用透析和离子交换层析分离纯化坛紫菜，所得纯度达到1.15。SUN L等8采用Sepharose CL-4B和Sephadex G-200两步凝胶过滤层析分离纯化得到R-藻红蛋白的纯度达到4.35。这些制备方法多是通过细胞破碎、硫酸铵盐析沉淀再结合多步柱层析来分离纯化藻红蛋白，其工艺复杂，得率偏低，生产成本较高，从而使高纯度的藻红蛋白价格居高不下，极大地限制了其应用9-11。红胞藻是一类单细胞隐藻，无细胞壁，易于实验室培养，细胞内只有藻红蛋白一种藻胆蛋白，且含量丰富12。因此使用红胞藻提取藻红蛋白具有细胞破碎容易、后期提纯简单的优点，可作为制备藻红蛋白的优良原料。本实验以红胞藻作为原料，采用一步层析法分离纯化藻红蛋白，并对其性质和稳定性进行考察，为红胞藻藻红蛋白的大规模制备提供了参考。1 材料与方法1.1 主要材料与试剂红胞藻藻种：本实验室保藏；SDS-PAGE电泳试剂盒及蛋白质分子质量标准：上海碧云天生物技术有限公司；Butyl-S-QZT 6FF：美国GE公司；其他试剂均为国产分析纯。1.2 主要仪器与设备DK-98-1电热恒温水浴锅：常州市伟嘉仪器制造有限公司；TDL-5低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；NanoOne超微量分光光度计：美国赛默飞世尔公司；CT15RT台式高速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特股份有限公司。1.3 实验方法1.3.1 藻红蛋白的分离纯化1.3.1.1 反复冻融法破碎藻细胞 将培养的红胞藻藻液以5000 r/min离心3 min，去除上清液，获得新鲜藻体。按照1:10的比例加入磷酸盐缓冲液(20 mmol/L、pH6.8)进行洗涤。充分混匀后的溶液放置在20 冰箱中，充分冻结后取出置于4 条件下融解，融解后的上清液混匀离心(1000 r/min，5 min)处理，取上清液样品进行全波长扫描，反复冻融几次，通过比较藻红蛋白溶出率判断红胞藻细胞冻融破碎最佳次数。溶出率(mg/g)=溶出的藻红蛋白总量(mg)/藻体phycoerythrin(A545/A280)could be increased to 2.45 by two-step ammonium sulfate fractional precipitation.After further using Butyl-S-QZT 6FF hydrophobic chromatography,the purity of phycoerythrin(A545/A280=6.63)reached reagent level,and the recovery rate was 48.9%.The purified phycoerythrin has the largest characteristic absorption peak at 545 nm,the fluorescence excitation peak at 541 nm and 553 nm,and the emission peak at 587.5 nm.The secondary structure is mainly composed of-helix.Phycoerythrin contains three subunits,with molecular weights of 9 ku,10 ku and 20 ku respectively.It can remain relatively stable at 3050 and pH 68.Cu2+has a certain effect on the spectral properties of phycoerythrin.In the presence of Ca2+,Mn2+,Zn2+,Fe2+,Fe3+,the spectral properties of phycoerythrin have not changed significantly.Conclusion:Reagent grade phycoerythrin was obtained by ammonium sulfate fractionation precipitation and one-step hydrophobic chromatography,with high yield and simple process.This study provides a basis for the large-scale production of phycoerythrin from Rhodomonas sp.Key words:Rhodomonas sp;phycoerythrin;separation and purification;stability 232 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期鲜重(g)1.3.1.2 硫酸铵饱和度对藻红蛋白提取纯度和回收率的影响(1)硫酸铵一步盐析：取冻融破碎后的粗提液，分别加入硫酸铵至20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%饱和度，缓慢加入硫酸铵并不断搅拌，避免一次过量加入硫酸铵使得藻红蛋白局部变性，充分搅拌溶解后在4 条件下静置过夜。取出后以10000 r/min离心10 min，沉淀用一定量的磷酸盐缓冲液(20 mmol/L、pH6.8)溶解，使用超微量分光光度计测定545 nm和280 nm处的吸收值13，选择纯度和回收率较高的硫酸铵饱和度。(2)硫酸铵二步盐析：将一步盐析所得回收率相对较高的上清液进行二次盐析。选用20%上清液加入硫酸铵边加边搅拌使其饱和度达到一次盐析的最佳效果，最终硫酸铵饱和度达到80%，置于4 条件过夜。离心处理(10000 r/min，10 min，4)，所得沉淀加入磷酸缓冲液(20 mmol/L、pH6.8)进行溶解。样品进行全波长扫描，计算其纯度和回收率。1.3.1.3 疏水层析 采用疏水层析介质Butyl-S-QZT 6FF(Vt=2.5 cm10 cm)，用磷酸盐缓冲液(含2.5 mol/L(NH4)2SO4的20 mmol/L PBS pH6.8)平衡12个柱床体积后即可上样，用2 mol/L(NH4)2SO4溶液进行洗杂。对两步盐析所得藻红蛋白粗提液进一步分离纯化，进行梯度洗脱，流速为2 mL/min，最终用磷酸盐缓冲液将藻红蛋白完全洗脱下来。对洗脱所得组分进行全波长扫描，计算其纯度和回收率。1.3.2 藻红蛋白含量和回收率(T)的计算(1)含量计算：PE(mg/mL)=A545/12.6 式