红芪多糖介导STAT3通路...卵巢癌小鼠肿瘤细胞免疫逃逸_蒋鸿晶.pdf

免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023 论著 文章编号1000-8861（2023）03-0233-08；DOI10.13431/ki.immunol.j.20230030红芪多糖介导STAT3通路抑制卵巢癌小鼠肿瘤细胞免疫逃逸蒋鸿晶，仲国庆，张洋*摘要 目的 探讨红芪多糖（HPS）介导信号转导子与转录激活子3（STAT3）通路抑制卵巢癌小鼠肿瘤细胞免疫逃逸的作用。方法 取40只Balb/c小鼠通过皮下注射卵巢癌SKOV3细胞建立卵巢癌小鼠模型，将建模成功的小鼠随机分为模型组、米非司酮（MIF）组、HPS组、HPS+MIF联合组。HPS组灌胃给予HPS（200 mgkg-1d-1），MIF组灌胃给予MIF（40 mgkg-1d-1），HPS+MIF联合组灌胃给予HPS（200 mgkg-1d-1）和MIF（40 mgkg-1d-1），模型组灌胃给予等量无菌生理盐水，连续干预14 d。观察记录各组小鼠瘤体积、瘤质量并计算抑瘤率；酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测小鼠外周血白介素-2（IL-2）、白介素-10（IL-10）、转化生长因子-1（TGF-1）水平；流式细胞术检测各组小鼠肿瘤组织中CD4+、CD4+CD25+叉头框蛋白P3+（Foxp3+）调节性T细胞（Treg）水平；实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测各组小鼠肿瘤组织STAT3、程序性死亡配体-1（PD-L1）、程序性死亡受体1（PD-1）信使核糖核糖酸（mRNA）表达；蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测各组小鼠肿瘤组织STAT3、PD-L1、PD-1蛋白表达。结果 与模型组比，MIF组、HPS组、HPS+MIF联合组小鼠瘤体积和瘤质量、外周血IL-2、IL-10、TGF-1水平以及肿瘤组织CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞水平降低，肿瘤组织中CD4+细胞水平升高，差异均有统计学意义（P0.05）；与MIF组和HPS组比，HPS+MIF联合组小鼠瘤体积和瘤质量、外周血IL-2、IL-10、TGF-1水平以及肿瘤组织CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞水平降低，肿瘤组织中CD4+细胞水平升高，差异均有统计学意义（P0.05）。与模型组比，MIF组、HPS组、HPS+MIF联合组小鼠肿瘤组织STAT3、PD-L1、PD-1 mRNA及蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P0.05）；与MIF组和HPS组比，HPS+MIF联合组小鼠肿瘤组织STAT3、PD-L1、PD-1 mRNA及蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P0.05）。结论 HPS对卵巢癌小鼠肿瘤细胞免疫逃逸有一定抑制作用，推测可能是通过介导STAT3信号通路抑制STAT3、PD-L1、PD-1的表达实现上述作用的。关键词 红芪多糖；信号转导子与转录激活子3；肿瘤细胞；免疫逃逸中图分类号 R737.31文献标识码 AHedysarum polysaccharide mediates the STAT3 pathway to inhibitthe immune escape of tumor cells in ovarian cancer miceJIANG Hongjing1,ZHONG Guoqing2,ZHANG Yang1,*1.Division 1 of Gynaecology Department,Tengzhou Central Peoples Hospital Affiliated to Jining Medical College,Tengzhou 277599,China;2.Department of Obstetrics,Jining First People s Hospital,Jining 272000,China*Corresponding Author:ZHANG Yang,E-mail:Abstract This study was performed to investigate the effect of hedysarum polysaccharide(HPS)-mediatedsignal transducer and activator of transcription 3(STAT3)pathway in inhibiting the immune escape of tumor cells inovarian cancer mice.A mouse model of ovarian cancer was established by subcutaneous injection of ovarian cancerSKOV3 cells in 40 Balb/c mice,and the mice that were successfully modeled were randomly divided into modelgroup,mifepristone(MIF)group,HPS group,HPS+MIF joint group.The tumor volume and tumor mass of the mice ineach group were observed and recorded,and the tumor inhibition rate was calculated.The levels of interleukin-2(IL-2),IL-10 and transforming growth factor-1(TGF-1)in peripheral blood of mice were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Flow cytometrywas used to detect the levels of CD4+,CD4+CD25+forkhead box protein P3+(Foxp3+)regulatory T cells(Treg)in tumor tissues of mice in each group.Theexpression of STAT3,programmed death ligand-1(PD-基金项目：济宁医学院院级科研项目（JY2017FS036）作者单位：277599滕州，济宁医学院附属滕州市中心人民医院妇一科（蒋鸿晶，张 洋）；272000，济宁市第一人民医院产科（仲国庆）*通信作者：张洋，E-mail：233免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，其死亡率位居妇科恶性肿瘤之首。因卵巢癌发病隐匿，且缺乏有效的筛查诊断方法，多数患者确诊时已为晚期，5年生存率仅在2030左右1。近年来，卵巢癌在外科治疗和药物化疗方面取得了重大进展，但患者复发率和死亡率仍居高不下，因此，寻求更加有效的治疗手段对提高卵巢癌患者的生存率有重要意义。有研究显示2，卵巢癌肿瘤细胞可通过调节免疫细胞比例，分泌白介素-2（IL-2）、白介素-10（IL-10）、转化生长因子-1（TGF-1）多种免疫抑制因子，抑制机体抗肿瘤免疫应答反应，从而使肿瘤细胞逃避机体免疫监视在体内生长增殖，促进肿瘤的发生发展。信号转导子与转录激活子3（STAT3）是STAT家族的主要成员之一，可通过上调上述免疫抑制因子（IL-2、IL-10、TGF-1）的表达，促进肿瘤的发展和转移3。米非司酮（MIF）作为一种孕激素受体拮抗剂，多用于终止早、中期妊娠及紧急避孕。近年来发现MIF在包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤具有抗肿瘤活性4-5，因此，本研究选取MIF作为阳性对照药物以排除假阴性结果。红芪多糖（HPS）是中国传统中药红芪的主要活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫活性等作用6。李力等7报道，HPS可以有效促进卵巢癌SKOV3细胞凋亡，并降低细胞增殖和迁移能力，但有关HPS抑制肿瘤细胞免疫逃逸的作用尚未见相关报道。本研究通过构建卵巢癌小鼠模型，探究HPS介导STAT3通路抑制卵巢癌小鼠肿瘤细胞免疫逃逸的可能性。1材料与方法1.1动物及细胞40只46周龄SPF级Balb/c雌性小鼠，体质量（23.652.27）g，购自浙江普康生物技术股份有限公司 许可证号 SCXK（浙）2019-0032；卵巢癌SKOV3细胞（购自中国科学院细胞库，货号CRKL-0215）。1.2药物与试剂MIF购自美国SIGMA公司（货号M8046-100MG）；HPS（纯度90%）购自四川省维克奇生物科技有限公司，经青岛科标检测研究院有限公司检验合格；白介素-2（IL-2）、白介素-10（IL-10）、转化生长因子-1（TGF-1）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自美国Cygnus公司（货号F550、F257、F514）；异硫氰酸荧光素（FITC）、碘化丙啶（PI）购自上海联迈生物工程有限公司（货号 LM-046、LM-022）；聚合酶链反应（PCR）荧光定量试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司（货号LM-90408）；信号转导子与转录激活子3（STAT3）、程序性死亡配体-1（PD-L1）、程序性死亡受体1（PD-1）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）兔抗鼠单克隆抗体购自美国 Invitrogen 公 司（货 号 PA3-031A、PA1-1110、MA1-980、PA1-830）；STAT3、PD-L1、PD-1、GAPDHL1)and programmed death receptor 1(PD-1)messenger ribonucleic acid(mRNA)in mouse tumor tissue.Westernblot was used to detect the expression of STAT3,PD-L1,PD-1 proteins in mouse of each group.Compared with themodel group,the tumor volume and tumor mass,the levels of IL-2,IL-10,TGF-1 in peripheral blood,and thelevels of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in tumor tissue of mice in MIF group,HPS group,and HPS+MIF combinationgroup decreased,and the level of CD4+cells in tumor tissue increased,the differences were statistically significant(P0.05).Compared with the MIF group and the HPS group,the tumor volume and tumor mass,the levels of IL-2,IL-10,TGF-1 in peripheral blood and the levels of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in the tumor tissue of the mice in theHPS+MIF combination group decreased,the level of CD4+cells in tumor tissues increased(all P0.05).Comparedwith the model group,the mRNA and protein expressions of STAT3,PD-L1 and PD-1 in the tumor tissues of themice in the MIF group,HPS gro