牛尿中β-雌二醇残留量的测定 气相色谱-负化学电离质谱法 GBT 20749-2006.pdf

GB/T20749-2006前言本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国拳皇岛出入境检验检疫局提出。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：庞国芳、王建华、李杰、刘靖靖、蔡发，本标准系首次发布的国家标准。GB/T20749-2006牛尿中阝雌二醇残留量的测定气相色谱-负化学电离质谱法1范围本标准规定了牛尿中B雌二醇残留量气相色谱负化学电离质谱测定方法。本标准适用于牛尿中B-雌二醇残留量的测定。本标准的方法检出限：0.25g/L。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括恸误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1-2004,1S05725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004，IS05725-2:1994,IDT)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992，neq IS03696:1987)3原理牛尿中雅二醇经过醇水解和固相萃取柱净化后、经酰化衍生化后，用气相色谱-负化学电离质谱选择离子监测模式测定，内标法定量。4试剂和材料除另有规定外，试剂均为分析纯：水为GB/T6682规定的一级水。4.1B葡糖苷酸酶和芳基硫酸苷酶：Hix pomatia,.含B葡糖苷酸酶100000单位/mL,硫酸酯酶1000单位/ml.4.2甲醇：色谱纯。4.3四丁基甲醚(MTBE):色谱纯。4.4乙酸乙酯：色谱纯。4.5正己烷：色谱纯。4.6吡啶：色谱纯。4.7异辛烷：色谱纯。4.8衍生化试剂：五氟苯甲酰须，在避光、防潮环境冷东储截。4.9碳酸氢钾。4.10三水乙酸钠.4.11无水硫酸钠。4.12甲醇十水溶液(1十1)：取100mL甲醇(4.2)和100mL水充分混合。4.13甲醇+四丁基甲醚溶液(1+9)：取20mL的甲醇(4.2)和180mL四丁基甲醚(4.3)充分混合。4.14乙酸钠缓冲液(pH=5.2):称取43g三水乙酸钠(4.10)用水溶解，加入25.2g冰乙酸用水定容1GB/T20749-2006至1000mL,有效期6个月。4.15干燥乙酸乙酯：在密封试管中加入500mg无水硫酸钠和20mL乙酸乙酯，振荡混合约30min后，2000r/min离心10min。4.16乙酸乙酯十吡啶(90+10)：将10mL吡啶和90mL干燥的乙酸乙酯混合，室温保存。一周内使用。4.17碳酸氢钾(KHCO3)溶液：0.5mol/L。称5 g KHCO3于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。一周内有效。4.18 Oasis HLB固相萃取柱：60mg,3mL或相当者。使用前分别依次用3mL四丁基甲醚(4.3)，3mL甲醇(4.2)，3mL纯水活化，保持柱体湿润。4.19标准物质：P-堆二醇，纯度99%。4.20内标标准物质：B雌二醇-2,4,16,16-D4,纯度99%。4.21B堆二醇标准溶液：准确称量10mg标准物分别于100mL容量瓶中，用甲醇(4.2)定容至刻度，浓度100g/mL,储备液贮存于一20，有效期一年。再以甲醇稀释成适用浓度的溶液，保存于4冰箱中。4.22内标标准溶液：准确称量10mg标准物分别于100mL容量瓶中，用甲醇(4.2)定容至刻度，浓度100g/mL,储备液贮存于一20C,有效期一年。再以甲醇稀释成适用浓度溶液，保存于4冰箱中，可使用三个月。4.23标准工作溶液：将B雌二醇标准溶液(4.21)和B雌二醇D4(4.22)混合，按照7.3步骤衍生化后备用。5仪器5.1气相色谱-质谱仪：配有负化学源。5.2离心管：5mL和10mL,具塞。5.3移液器：20L100L,200L1000L.5.4分析天平：感量0.1mg和0.01g。5.5离心机。5.6涡旋混匀器。5.7氮气浓缩仪。6试样的制备与保存6.1试样的制备取有代表性样品，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品瓶中，密封，并做上标记。6.2试样保存将试样置于28C下保存，7测定步骤7.1提取准确移取2.0L牛尿，置于5mL具塞离心管中，加入2mL乙酸钠缓冲液(4.14)、20LB葡糖苷酸酶和芳基硫酸苷酶(4.1)、100L内标溶液(4.22)于每个样品中，混匀，于37C过夜。7.2净化将提取液(7.1)移人下接Oasis HLB柱(4.18)的贮液器中，溶液以1mL/min的流速通过OasisHLB柱，待溶液完全流出后，用甲醇+水(4.12)洗柱，弃去全部淋出液。最后用6mL甲醇十四丁基甲酷(4.13)洗脱，收集洗脱液于10L具塞离心管(5.2)中，用氮气浓缩仪(5.6)吹至约剩余500L溶2