牛病毒性腹泻粘膜病诊断技术 GBT 18637-2002.pdf

GB/T18637-2002前言牛病毒性腹泻/粘膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起的牛的一种以粘膜发炎、糜烂，坏死和腹泻为特征的疾病。应用微量血清中和试险检查BVD/MD抗体，具有其特殊意义，它不仅可以定性，而且还可以定量，并从抗体量的动态变化中，可以判定病牛是以前感染过本病，还是现在正在感染过程中，从而为防治本病提供科学依据。本标准的附求A、附录B、附录C都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国兽药监察所，农业部动物检疫所。本标准主要起草人：邵振华、郑志刚。GB/T18637-20023.2.2.4精液冻融3次（或超声波裂解处理），用细胞培养液作1：10倍稀释，离心取上清液。3.2.2.5鼻分泌物：用含1000IU(mg)/mL双抗”的培养液4倍稀释后，离心取上清液.以上各样品处理后均需作无菌检验。3.2.3样品的接种培养3.2.3.1将10mL牛翠丸原代细胞（见附录C)接种于小扇瓶，置37C静止培养.培养到细胞形成80%以上单层。32.3.2取出3.2.3.1中小扁瓶，倒去培养液，接种3.2.2.13.2.2.5的样品，每瓶接种样品1mL每份样品接种3瓶。3.2.3.3置37C吸附2h3h。3.2.3.4吸附后，将样品倒去，加维持液见附录B中B1,另加3%犊牛血清(3.1.4)10mL置37C恒温培养。3.2.3.5培养6d后，将其冻融3次，收集3瓶细胞及其培养基，混合后即为样品分离细胞培养物。3.3样品分离物的病毒鉴定33.1分离物的细胞玻片培养3.3.1.1将1mL牛翠丸原代细胞悬液，接种于带盖玻片(3.1.5)的Leightons管，置37C培养，至盖玻片上细胞生长成80%的单层。3.3.1.2取3.3.1.1中4个Leightons管，倒去培养收，每瓶接种3.2.3.5中样品分离细胞培养物1ml。3.3.1.3置37C吸附2h3h.3.3.1.4吸附后，加维持液1mL,置37C恒温培养3d。3.3.1.5取出细胞玻片，用磷酸盐缓冲液（见附录A中A1)轻轻漂洗，倾去液体，自然干燥。用纯丙酮室温固定10minl5min。3.3.1.6取各组固定后的细胞玻片（样品组取半数，余者在必要时作抑制染色试验用），置湿盒内，细胞面向上，滴加BVD/MD-FA(3.1.2),并使免疫荧光抗体(FA)铺满而又不溢出于细胞面。将湿盒盖盖严，置37C染色2h。随后取出，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，倾去液体。3.3.1.7封片：将细胞面向下，用碳酸盐级冲甘油（见附录A中A2)封贴于载玻片上。3.3.2对照3.3.2.1阳性参照组：取3.3.1.1中带有细胞玻片的L.eightons管2管，每管接种0.1mL100 TCID的OregonCzV(3.1.1),此后按3.3.1.33.3.1.7方法操作。3.3.2.2阴性对照组：取3.3.1.1中带细胞玻片的Lightons管2管，按3.3.1.53.3.1.7方法操作。3.3.3镜检3.3.3.1被BVD/MDV感染的细胞，在蓝紫光激发的荧光显微镜下，胞浆呈黄绿色的荧光，并常见有闪烁明亮黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内。未感染细胞无荧光。3.3.3.2荧光观察记录：荧光在激发光照射下，随时间延长而明显减粥，因此在染色后，应尽快镜检及时记录，记录可分为：a)(一)无荧光：b)(十)荧光微弱，形态不清晰；c)(十十)荧光较亮，形态清晰；d)(十+十十+)荧光较强，明亮闪烁，形态清晰。3.3.4荧光抑制试验1)双抗指青霉素(U)和链霉素(4g)。