猪肝脏、肾脏、肌肉组织中维吉尼霉素M1残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 GBT 20765-2006.pdf

GB/T20765-2006前言本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国拳皇岛出入境检验检疫局提出。本标准由中华人民共和国质量监督检验检疫总局归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：庞国芳、李一尘、宋文斌、董振霖、李军、隋凯、姜莉。本标准系首次发布的国家标准。GB/T20765-2006猪肝脏、肾脏、肌肉组织中维吉尼霉素M,残留量的测定液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了猪肝脏、肾脏和肌肉组织中维吉尼霉素M残留量液相色谱-串联质谱测定方法。本标淮适用于猪肝脏、肾脏和肌肉组织中维吉尼霉素M残留量的测定。本标准的方法检出限为：猪肝脏、肾脏和肌肉组织中维吉尼霉素M为0.25gkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测定方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1-2004,1S05725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测定方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004，IS05725-2:1994,IDT)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992，neq IS03696:1987)3原理试样中残留的维吉尼霉素M,在甲醇十乙脂中匀浆提取、离心、取上清液用磷酸二氢铵缓冲溶液稀释，于C固相萃取柱进行净化。将洗脱液中的维吉尼霉素M用三氯甲烷分离萃取，去除水层。氮吹三氯甲烷至干，用甲酸铵缓冲溶液与甲醇混合液溶解并定容，供液相色谱-串联质谱仪测定。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙酸。4.2甲酸：色谱纯。4.3甲醇：色谱纯。4.4乙腈：色谱纯。4.5三氯甲烷：色谱纯。4.6碱酸二氢铵：优级纯。4.7甲酸铵：优级纯。4.8磷酸二氢铵溶液：0.1mol/L,称取11.50g磷酸二氢铵(4.6)，用水溶解定容至1000mL。4.9磷酸二氢铵溶液：0.01mol/L,称取0.1mol/L磷酸二氢铵溶液(4.8)100mL,用水稀释定容至1000mL。4.10甲酸铵缓冲液：0.12mol/L,pH=3.2,称取7.56g甲酸铵(4.7)，用水溶解，用甲酸(4.2)调节pH到3.2，定容至1000mL,4.11甲酸铵缓冲液：0.003mol/L,pH=3.2,称取25.0mL的甲酸铵缓冲液(4.10)，用水稀释定容至1GB/T20765-20061000ml。4.12甲醇十乙腈溶液(50十50)。4.13水十乙腈溶液(80+20)。4.14水十甲醇溶液(65十35)。4.15水十甲醇溶液(45十55)。4.16流动相A:0.003mol/L甲酸铵缓冲液(4.11)用0.22m滤膜过滤。流动相B:甲醇十乙腈(50十50)(4.12)用0.22m滤膜过滤。4.17标准物质：维吉尼霉素M,纯度95%。4.18标准储备溶液：0.1mg/mL。准确称取适量的维吉尼霉素M,标准物质，用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备溶液。该溶液在4保存。注：称取标准物的质量是按纯度修正过的质量。4.19标准工作溶液：根据维吉尼霉素M的灵敏度和仪器线性范围，用空白样品提取液配成不同浓度的标准工作溶液。标准工作溶液在4保存。5仪器5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。5.2离心机：最大转速为10000r/min.5.3离心管：锥形底玻璃离心管40mL、15mL和10mL,具塞；锥形底聚丙烯离心管50mL,具螺旋盖。5.4电子天平：感量0.1mg和0.1g。5.5过滤器：聚四氟乙烯膜过滤器：0.22m13mm;尼龙膜过滤器：0.22m47mm。5.6移液器：量程为1mL10mL和5mL50mL.5.7微量加液器：量程为10L100L,100L1000L。5.8高速分散匀质机。5.9流动相过滤装置。5.10氮气浓缩仪。5.11高速涡流混合器。5.12振荡器。5.13酸度计：测量精确度为0.02。5.14超声波仪。5.15食物调理机.5.16一次性注射器：1mL。5.17固相萃取柱：Bond Elut C1s,500mg,柱长为6mL。5.18鸡心瓶：150mL。5.19玻璃贮液器：100mL。5.20试样瓶：2mL。5.21一次性移液管。6试样的制备与保存6.1试样的制备猪肝脏、肾脏要去除脂肪和其他的非肝脏、肾脏组织，猪肉要去皮和骨头。将其搅碎拌匀。分出0.5kg作为试样，将制备好的试样密封，并做上标记。2GB/T20765-20066.2试样保存将试样置于一18条件下贮存。7测定步骤7.1提取称取试样5.00g(精确到0.01g)放入50mL聚丙烯离心管中，加入10mL的甲醇十乙腈溶液(50十50)匀浆1min,用21mL的甲醇+乙腈溶液(50十50)彻底清洗匀浆头。高速振荡10min,离心15min(4000r/min),将上清液转移至40mL的洁净离心管中。再向残渣中加入2mL甲醇+乙睛溶液(50+50)匀浆30s,依上述条件清洗匀浆头。高速振荡5min,离心10min(4000r/min)。合并两次上清液于40mL离心管中。加入15mL的0.01mol/L磷酸二氢铵溶液(4.9)，高速振荡5min,离心10min(4000r/min)。将上清液转移至150mL的鸡心瓶中，加入80mL磷酸二氢铵溶液(4.9)混匀待净化。7.2净化依次用5mL乙腈，5mL水和5mL的磷酸二氢铵溶液(4.9)洗涤活化固相萃取柱(5.17)。在柱上装上玻璃贮液器(5.19)，将样液(7.1)过柱，移去玻璃贮存器(5.19)。依次用2mL水，10mL水十乙腈溶液(80十20)，2mL水和水十甲醇溶液(65十35)洗柱，弃去全部流出液。最后用5mL水十甲醇溶液(45十55)洗涤维吉尼霉素M1,收集洗脱液到15mL的玻璃离心管中。将10mL三氯甲烷(4.5)加人洗脱液中，振荡5min,离心10min(4000r/min)。用一次性移液管定量收集三氯甲烷层到10mL离心管中，在40C条件下氨吹至干。再向离心管中加人500L甲醇，超声5min,加入500L甲酸铵缓冲液(4.11),高速涡旋5s。样液用0.22m的滤膜过滤到样品瓶中，供液相色谱-串联质普仪测定。7.3色谱测定7.3.1液相色谱条件a)色谱柱：SunFire Cis,5m,150mmX2.1mm(内径)或相当者；b)柱温：40C;c)进样量：30L:d)色谱柱总流量：300L/mine)流动相及梯度见表1。表1流动相及梯度时间/min流动相A/(%)流动相B/(%)0.0093720.00406026.00406028.0093735.009377.3.2质谱条件a)离子源：电喷雾离子源：b)扫描方式：正离子扫描：c)检测方式：多反应检测；d)电喷雾电压(1S):5000V;e)雾化气压力(CAS1):517.1kPa:D气帘气压力(CUR):103.4kPa:g)辅助气压力(CAS2):620.5kPa: