猪链球菌2型三重PCR检测方法 GBT 19915.4-2005.pdf

GB/T19915.4-20054.2.11猪链球菌2型三重PCR反应混合物。4.3仪器和设备4.3.1离心机。4.3.2DNA热循环仪。4.3.3核酸电泳仪。4.3.4pH计。4.3.5移液器：10L、20L、100L、1000L。4.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统。4.3.7恒温水浴锅。4.4PCR操作步骤4.4.1阳性对照和阴性对照DNA模板的提取分别将猪链球菌2型HA9801、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株接种于5%犊牛血清Todd-Hwit肉汤培养基，37摇振培养18h,用革兰氏阳性细菌柱离心式基因组DNA小量抽提试剂盒提取DNA模板，一20C保存备用。4.4.2PCR扩增用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型三重PCR反应混合物的PCR管中，混匀，加入Taq酶(2U/L)0.7L,2000r/min离心10s,立即进行PCR扩增；同时设去离子水的空白对照、猪链球菌2型HA9801株基因组DNA模板的阳性对照、马链球菌兽疫亚种ATCC35246和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板的阴性对照。扩增条件为：94C预变性5min:94C30s,55C30s,72C40s,30个循环：72延伸7min,4C保存。4.4.3琼脂糖凝胶电泳在电泳缓冲液中加人1%琼脂糖，加热融化后加入溴化乙錠制备凝胶，凝固后进行电泳。8L酶切产物加入2L5上样缓冲液，混匀后加人上样孔，80V恒压电泳20min,紫外线透射检测。5结果及判断5.1试验结果成立条件阳性对照HA9801株经PCR扩增出现约858bp、387bp和316bp三条条带，去离子水的空白对照、马链球菌兽疫亚种ATCC35246和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板的阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立，否则，结果不成立。5.2结果判断琼脂糖凝胶电冰后，在紫外线投射下检测，在空白和阴、阳性对照成立的情况下，待检样品只出现387bp一条条带，可判定为猪链球菌2型，待检样品出现约387bp、316bp和858bp三条条带，或出现387bp和858bp两条条带，可判定为猪链球菌2型致病菌株：待检样品只出现858bp一条条带，可判定为非猪链球菌2型的致病菌：待检样品不出现条带，结果为阴性。6废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。