猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法 GBT 23815-2009.pdf

ICS67.050X04B中华人民共和国国家标准GB/T23815-2009猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法Protocol of the polymerase chain reaction for detecting plant components in meat2009-05-27发布2009-09-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T23815-20096.2.2琼脂糖：电泳纯。6.2.3Tris饱和酚。6.2.4三氯甲烷。6.2.5冰乙酸。6.2.6无水乙醇.6.2.7异戊醇。6.2.8异丙醇。6.2.9氢氧化钠(NaOH).6.2.10盐酸(HCI)。6.2.11三羟甲基氨基甲烷(Tris)。6.2.12乙二胺四乙酸钠盐(Naz EDTA)。6.2.13蔗糖，6.2.14溴酚蓝。6.2.15乙酸钠(NaAc)。6.2.16米酚十三氯甲烷十异戊醇(25十24十1，体积比)。6.2.17三氯甲烷十异戊醇(24十1，体积比)。6.2.18乙酸钠溶液：3mol/L乙酸钠溶液，乙酸调节pH为5.2.6.2.191TAE电泳级冲液：取50TAE(242gTis,57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LNa2EDTA,用HCI或NaOH周节pH至8,0，定容至1L)按比例稀释。6.2.20TE级冲液：Tris0.01mol/L,Na:EDTA0.001mol/L,用HCI或NaOH调节pH至8.0，6.2.21PCR试剂盒：Taq酶，dNTPs,10 X Buffer,氯化镁(MgCl2)。6.2.22上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖溶液。6.2.23溴化乙锭溶液：1mg/mL,6.2.2470%乙醇。6.2.25等效DNA提取试剂盒。6.2.26DNA分子质量标准品(50bp)。6.3主要仪器6.3.1PCR热循环仪。6.3.2电泳仪。6.3.3凝胶成像系统。6.3.4离心机：12000r/min.6.3.5涡旋振荡器。6.3.6分析天平：0.1g。6.3.7微量可调移液器：0.5L,2L,10L,20L,100L,200L,1000L.6.3.8核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.4检测步骤6.4.1模板DNA的提取6.4.1.1对照阳性对照：猪基因组DNA、植物基因组DNA:阴性对照：已知以不含该基因的样品提取的DNA:空白对照：双蒸水(ddH2O)。6.4.1.2提取步骤a)样品DNA提取时设双平行：2GB/T23815-2009b)将样品粉碎，取适量样品放入2.0mL离心管，加入400LTE缓冲液(6.2.20)，于65C水浴中溶解10min,上下顿倒混匀；c)加入与溶液等体积苯酚十三氯甲烷十异戊醇(25十24十1)(6.2.16)，摇晃混匀10min:d)12000r/min室温离心10min,将上清液转移至另一千净的1.5mL离心管中，e)加入上清液等体积三氯甲烷十异戊醇(24十1)(6.2.17)，摇晃混匀10min:D12000r/min室温离心10min,小心吸取上清液：g)加入上清液1/10体积乙酸钠溶液(6.2.18)、2倍2.5倍体积经一20预冷的无水乙醇(6.2.6),颠倒混匀后一20静置1h:或加入等体积异丙醇(6.2.8)，混匀后室温静置10min:h)12000r/min室温离心10min,弃去上清液；i)70%乙醇(6.2.24)洗涤沉淀2次3次，干燥DNA:j)50L0.1TE(6.2.20)溶解沉淀，4保存。也可以用等效DNA提取试剂盒(6.2.25)提取DNA,按试剂盒操作说明书指示进行操作。6.4.2DNA质量的测定样品中提取的DNA质量的测定用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计(6.3.8)进行测定。取适量DNA溶液加TE缓冲液(6.2.20)进行稀释，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值Az,和Az0。DNA的浓度按式(1)计算：c=AN50/1000nnn8 A444844444(1）式中：c一DNA浓度，g/LA一260nm处的吸光值：N一核酸稀释倍数。当Azo/A2o比值在1.4以上时，可用于PCR扩增，1,72.0之间时，PCR扩增效果好。6.4.3PCR扩增6.4.3.1PCR反应体系检测肉制品内、外源基因的PCR反应体系见表2。每个反应体系应设置两个平行反应。同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。表2PCR反应体系加人PCR反应体系的体积/试剂名称贮备液浓度L10X PCR Buffer一2.5MgCk25 mmol/L2.5dNTP2.5 mmol/L2.0正：0.25Primers20 pmol/aL反：0.25Taq5 U/aL0.15Template0.1g/L0.2g/LddH:O补足反应体系总体积为25