猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 GBT 27540-2011.pdf

GB/T27540-20116.3.4排泄物挑取少许粪便样本于离心管中，加入适量生理盐水，振荡混匀，室温3000g离心15，取上清液转入离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转入离心管编号备用。6.3.5细胞培养物细胞培养物冻融3次，转人离心管中编号备用。6.4存放与运送采集或处理的样品在28条件下保存应不超过24：若需长期保存，应放置一70冰箱，但应避免反复冻逊（冻融不超过3次），采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6h一8h之内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。7实时荧光RT-PCR检测7.1核酸提取在样本制备区进行。7.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数重复数3十阳性管数十弱阳性管数十阴性管数，对每个离心管进行编号。7.1.2每管加入500 L Trizo1,分别加入被检样品、阳性对照、弱阳性对照和阴性对照各200L(由于阳性和弱阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染)，颠倒10次混匀，静置5i:再加人200L氯仿，混匀器上振荡混匀5s(也可以用手反复颠倒混匀)。于4、12000g离心15min。7.1.3取与7.1.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，加人500L异丙醇(4预冷)，对每个管进行编号。取7.1.2中离心后的上清液约500L(注意不要吸出中间层)转移至相应的管中，颠倒混匀，-20静置30min。7.1.4于4、12000g离心15min(离心管开口保持朝高心机转轴方向放置)，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入600L75%乙醇，颠倒洗涤。7.1.5于4、12000g离心10min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）。7.1.64000g离心10s(高心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3min10min。7.1.7加人38L经DEPC处理的水和2LRNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA,冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行荧光RT-PCR增：若需长期保存应放置一70冰箱。7.2荧光RT-PCR扩增体系的配制在反应混合物配制区进行。设PCR反应数为，其中n为待检样品数重复数3十阳性管数十弱阳性管数十阴性管数，每个样本测试反应体系配制见表1。配制完毕的反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。