猪链球菌2型多重PCR检测方法 GBT 19915.5-2005.pdf

GB/T19915.5-2005(pH8.8),1%Triton X-100.1mg/mL BSA.5.4dNTP混合液（各2.5mmol/L)5.5琼脂糖：电冰级5.6溴化乙锭5.7DNA分子量标准5.8TE缓冲液10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA.5.9核酸电泳缓冲液Tris碱242g,冰乙酸57.1mL,0.5mol/L EDTA100mL,加蒸馏水至1000mL,使用时10倍稀释。5.10电泳加样缓冲液0.25%溴酚蓝，40%蔗糖。5.11样品对照猪链球菌2型菌DNA提取物分别作为阳性对照，马链球菌兽疫亚种DNA提取物为阴性对照。6仪器和设备6.1台式冷冻高速离心机(13000r/min)。6.2DNA热循环仪.6.3核酸电冰仪和水平电泳槽。6.4凝胶成像系统（或紫外透射仪）。6.5可调移液器一套：10L、20L、200L和1000L。6.6恒温水浴箱。7操作方法7.1方法概要取培养菌液或从组织中提取的基因组DNA作为模板，加人到扩增猪链球菌和猪链球菌2型的PCR反应混合液中，进行PCR扩增：或直接将待检细菌培养进行PCR打增。最后通过琼脂糖凝胶电冰检测PCR产物，与DNA标准分子量进行比较，来确定打扩增产物的大小，在此基础上判定样品的检测结果。7.2样品采集在实验室生物安全柜中操作，将采集的组织样本别除包膜和其他结缔组织，选取内部实质部分，冻存于-20C备用。7.3组织样本DNA的制备采用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒，按说明书进行操作。7.4多重PCR扩增将培养的细菌纯培养物样品（不经过离心）1.2L、或者将制备的各样品DNA以及阳性和阴性对照DNA各1.5L分别加入到含有猪链球菌2型菌的PCR反应混合液的相应PCR反应管中缓冲液(含Mg2+),2L:dNTP,1.6L:引物1,0.6L:引物2,0.6L:引物3,0.6L:引物4,0.6L:酶0.2L:加水至总体积20L,2000r/min离心10s,加入Tag酶(5U/L)0.2L,2000r/min离心10s,采用DNA热循环仪立即进行PCR扩增。PCR扩增条件：94C7min:94C30s,60C30s,72C1min,40个循环；72C10min。扩增反应结