猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法 GBT 35901-2018.pdf

GB/T35901-20187.4.3组织样品：取1g解冻的组织，剪碎，加入2 mL PBS进行研磨，制备组织匀浆，8000r/min离心5min,取上清用于后续的核酸提取。7.4.4细胞培养物：4000r/min,4离心10min,取上清用于后续的核酸提取。8荧光PCR操作程序8.1DNA抽提8.1.1在核酸提取区操作。DNA抽提使用DNAzol试剂提取，也可以使用等效商品化试剂盒提取。8.1.2取n个灭菌的1.5L离心管，其中m为待检样品数十阳性对照十阴性对照，对每个离心管进行编号，8.1.3每管先加人800u1 DNAzol,再分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200L,顿倒10次混匀，4或室温10000r/min离心10min。8.1.4取900L上清，置新的1.5mL灭菌离心管中，加入500L无水乙醇，混匀，室温放置3min:4或室温10000r/min离心5min。8.1.5弃上清，沿管壁缓缓加人0.8mL1mL75%乙醇，颠倒3次6次混匀，410000r/min高心5mi。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液。8.1.6用50L8mmol/1Na0H溶液溶解沉淀，DNA在2一8冰箱可保存两个月，一20冰柜可稳定保存两年。8.2荧光PCR检测8.2.1反应体系的配制在试剂配制区进行。设实时荧光PCR反应管数为，n为待检样品数十阳性管数十阴性管数，每个反应的体系见附录C,为了避免移液器取样损失，建议按十1个反应进行配制。配制反应液在冰盒中进行。8.22反应液的分装将8.2.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀，按照每管39.8L分装于0,2mL透明PCR管内，将PCR管置于96孔板上，按顺序加样并做好标识，转移至核酸提取区。8.2.3加样在核酸提取区进行。在每个PCR反应管内加入0,2L的内参照质粒，并分别加入8.1制备的核酸10 L DNA溶液，盖上盖子，500r/min1000r/min离心30s。转移至检测区。8.2.4上机检测8.2.4.1荧光通道设置在检测区进行。将8.2.3中高心后的PCR管放人荧光PCR检测仪内，设置探针：5选择FAM和HEX两个荧光通道，3均选择无(None)。8.2.4.2循环条件设置与检测第一阶段，预反应50/2min:第二阶段，预变性95/2min:第三阶段，变性95/15s,退火、延伸、荧光采集60/30s,40个循环；