油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法 GBT 31793-2015.pdf

GB/T31793-2015AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA-3)。PCR反应总体积为30L,包含10mmol/L Tris-HCI,50mmol/LKCI(pH8.3),1.5mmol/L MgCl2,dATP、dGTP、dCTP、dTTP浓度均为100mol/L,引物浓度各为100nmol/L,模板DNA为2L,1.5 U Taq DNA聚合酶。反应循环程序为943min:9430s,67（引物Lm2/6为60）30s,7230s,35个循环（引物Lm2/Lm6第一轮打扩增25个循环)：最后725mi。第一轮扩增产物1L用作第二轮扩增的模板。取10L扩增产物与3L的6上样缓冲液混匀，在1.5%琼脂糖凝胶1TAE缓冲液中，4V/cm6V/cm电泳30min,溴化乙锭(EB)染色后在成像系统中成像分析。实时荧光PCR:引物Lm3(5-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3)/R2(5-GGCGCAAAATGTGCTGCGCT-3),探针Probe-M(5-FAM-CACTTGGGACTCGC-MGB3)。PCR反应体系为25L,包括12.5L2 X Premix Ex Taq、上下游引物(5mol/L)和探针(5mol/L)各1L、2L模板DNA,0.5L50 XROX Reference Dye，加无菌水补至25L。反应程序为：9510s;9515s,601min,40个循环。5鉴定特征5.1病菌形态初生菌丝无色，有分隔：菌丝呈白色放射状，初期可见结节状菌丝结，后期菌丝结形成黑色至褐色分生孢子器：分生孢子器球形至扁球形，褐色至深黑褐色，散生、埋生或半埋生于菌丝中，直径100m400m,顶部具孔口，周围有浅粉色、红色或紫色的黏性分生孢子团溢出，内含大量的分生孢子：分生孢子无色透明，椭圆形至纺锤形，内含2个油球，孢子大小(3.3m6.1m)(1.4m2.4um)。假囊壳在感病的木质化部位上产生，黑色，球形，埋生或爆裂，具孔口，直径360m500m:子囊棍棒形到圆柱形，双层壁，大小(70m120m)(10m17m),内含8个双列的子囊孢子，子囊孢子长椭圆形，黄褐色，具5个隔膜，大小(30m70m)(4m9m)。人工培养条件下未见有性型的形成。病菌形态图参见附录C中图C.1,与其近似种的形态比较参见附录D中表D.1。5.2PCR检测如常规PCR引物Lm3/九m4扩增产物为279bp,或引物LmacF/LmacR打扩增产物为331bp,视为油菜茎基溃场病菌阳性，如套式PCR引物Im2/1m6和Lm3/1m4扩增产物为279bp,视为油菜茎基溃疡病菌阳性。实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下：一C值小于或等于36，判定油菜茎基溃疡病菌阳性：一C1值大于或等于40，判定油菜茎基溃场病菌阴性，一C1值在3640之间，应重做实时荧光PCR,再次扩增后如C:值小于或等于36，或者C值大于或等于40，判定同上。6结果判定分离菌形态特征与5.1描述一致，且常规PCR、套式PCR或实时荧光PCR检测为阳性，可判定为油菜茎基溃扬病菌(Leptosphaeria maculans)。