旋毛虫实时荧光PCR检测方法 GBT 35904-2018.pdf

GB/T35904-2018前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位：东北农业大学、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局。本标准主要起草人：宋铭忻、张子群、李雅丽、韩彩霞、王海燕、李趣、李晓云、路义鑫。GB/T35904-201810XPCR反应缓冲液2.5ldNTP(2.5 mmol/L)1.5lMg2+(25 mmol/L)2.4L上游引物(10mol/L)0.5L下游引物(10mol/L)0.5L探针(10umol/L)0.3ulrTaq酶(5U/L)0.3lDNA模板5.0lPCR用水12.0L每次试险应设标准阳性、阴性和空白对照。标准阳性用阳性对照DNA做模板，标准阴性用阴性对照DNA做模板，空白对照用PCR用水做模板。8.2.3上机检测8.2.3.1荧光通道设置荧光素设定：报告荧光(report dye)设定为FAM,淬灭荧光(quench dye)设定为None,校准荧光(reference dye)设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。8.2.3.2循环条件设置与检测第一阶段，预变性95/2min:第二阶段，变性95/10s,退火，延伸、荧光采集60/30s,共40个循环。检测结束后，保存结果，根据收集的荧光曲线和C:值判定结果。9结果判定9.1质量控制读取每个样品C:值。标准阳性对照有特异性扩增曲线而且C值30，标准阴性对照和空白对照无特异性扩增曲线，说明质控合格。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。9.2结果描述及判定9.2.1被检样品有特异性扩增曲线，而且C:值30，判定为旋毛虫核酸阳性。9.22被检样品无特异性扩增曲线，判定为旋毛虫核酸阴性。9.2.3被检样品Ct值在3040之间，而且出现特异性扩增曲线需要重复取样检测，如重复检测的试验结果C:值40，而且出现特异性扩增曲线，判定为旋毛虫核酸阳性：否则，判定为旋毛虫核酸阴性。