哈氏刻肋海胆胚胎、幼体发育及人工养殖_洪继彪.pdf

第 38 卷第 2 期大连海洋大学学报Vol38 No22 0 2 3 年 4 月JOUNAL OF DALIAN OCEAN UNIVESITYApr 2 0 2 3DOI:1016535/jcnkidlhyxb2022-209文章编号:2095-1388(2023)02-0242-09哈氏刻肋海胆胚胎、幼体发育及人工养殖洪继彪，丁晟琦，常亚青，尹东红，王许波，宋坚*(大连海洋大学 水产与生命学院，农业农村部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023)摘要:为实现哈氏刻肋海胆(Temnopleurus hardwickii)的人工繁育，对其进行人工催产、授精、孵化、幼体培育及人工养成，并在显微镜下观察了哈氏刻肋海胆从受精卵到稚胆的发育过程。结果表明:通过注射KCl 溶液的方法催产，可以顺利促进哈氏刻肋海胆排放精卵，排出的卵受精率为 93.6%2.1%;哈氏刻肋海胆胚胎和幼体发育过程可分为受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠期、棱柱幼体、二腕幼体、四腕幼体、六腕幼体、八腕幼体和稚胆等 10 个时期;在水温 2324 条件下，受精卵在 50 min 时开始卵裂，5 h 时进入囊胚期，10 h 时进入原肠期，18 h 时进入棱柱幼体阶段，23 h 时进入二腕幼体阶段，1 d 16 h 时进入四腕幼体阶段，7 d 2 h 时进入六腕幼体阶段，10 d 16 h 时进入八腕幼体阶段，35 d 时变态为稚胆;与其他种类海胆相比，哈氏刻肋海胆在四腕幼体之前发育较快，在四腕幼体之后发育较慢。研究表明，在水温 2324、盐度 2932 条件下，哈氏刻肋海胆可以在室内实现人工育苗并进行人工繁殖。关键词:哈氏刻肋海胆;胚胎;幼体;发育过程;人工繁育中图分类号:S 968.9文献标志码:A哈氏刻肋海胆(Temnopleurus hardwickii)隶属于海胆纲(Echinoidea)拱齿目(Camarodonta)刻肋海胆科(Temnopleuridae)刻肋海胆属(Temno-pleurus)1，与细雕刻肋海胆(T.alexandri)的亲缘关系较近2，分布于中国的黄海、渤海、东海舟山群岛海域和台湾海峡。其壳较低平，呈半球形，最大壳径为 4.5 cm，高约 2 cm，步带狭窄，此间步带稍隆起(图 1)。哈氏刻肋海胆棘刺较细，呈规则排列，棘一节深一节浅，形态美观，观赏性极高，在水族造景中应用广泛，对水族缸内壁藻类的控制也有着较好的效果，有利于调节水质。因此，其观赏应用潜力较大。目前，有关哈氏刻肋海胆的研究较少，主要集中在其遗传进化和生态方面3-4。国外有关哈氏刻肋海胆的养殖文献也较稀少，仅见 Yaguchi 等5 对该海胆的生殖周期进行过研究。哈氏刻肋海胆种群数量较少，开展哈氏刻肋海胆的人工繁殖，不仅对生态环境的保护具有积极作用，而且缓解了水族造景等产业的需求。本研究中，首次探究了哈氏刻肋海胆人工繁育技术，并观察其胚胎及幼体发育过程，以期为该海胆的遗传和人工繁育提供基础资料。1材料与方法1.1材料试验用亲胆 200 枚，于 2018 年 9 月采自旅顺黄泥川海域(图 1)，壳径为 3.04.5 cm，活力充沛，体表无损伤，亲胆运送至大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室暂养 3 d。1.2方法1.2.1亲胆管理将哈氏刻肋海胆亲胆暂养于实验室内，自然光照，水温为(24.21.0)，盐度为 2932。暂养池中 24 h 充气，每天换水一次并投喂马尾藻，换水量为 2/3，换水时缓慢加水以减少对亲胆的刺激。1.2.2亲胆促熟通过投喂充足饵料对哈氏刻肋海胆亲胆进行促熟。温度较低时，可通过缓慢升温促熟，促熟过程中投喂海带、裙带菜、石莼及少量煮熟的贻贝，保证亲胆食物充足，使亲胆在性腺发育过程中有着较好的丰满度。自然光周期下，每天换水一次，换水量为 1/3，轻度充气，并用虹吸管收稿日期:2022-07-01基金项目:国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”项目(2018YFD0901603)作者简介:洪继彪(1997)，男，硕士研究生。E-mail:bater59 通信作者:宋坚(1970)，男，研究员。E-mail:dlmel 图 1哈氏刻肋海胆形态Fig.1Morphology of Temnopleurus hardwickii将亲胆所排粪便吸出，温度控制在 23 左右。1.2.3受精卵的获得与观察参考王宝锋等6 的方法对海胆进行催产。在 23.7 水温下，使用1 mL的注射器，分别从围口膜处给 10 枚亲胆注射0.5 mol/L 的 KCl 溶液 0.4 mL。注射 KCl 溶液后，将亲胆倒扣在 500 mL 的矿泉水瓶上。亲胆排精、产卵后，收集适量活力好的精子加入已经准备好的卵子中，轻轻搅动，等待卵子的受精。在显微镜下观察到卵子有极体放出时，表明该卵子已受精。取1 mL 精卵混合液在显微镜下观察受精卵的变化并记录数量。受精率(%)计算公式为受精率=2 细胞数量/总卵数量100%。1.2.4胚胎和幼体发育观察受精卵在水温 2324、盐度 2932 下进行孵化，受精时卵密度为6080 枚/mL。胚胎发育至纤毛囊胚期后上浮于水面，用虹吸法吸取上层囊胚进入育苗池进行培养，在选育时也可用孔径为 57 m 的筛绢网在水面上层进行筛选。选育后的优良胚胎发育至棱柱幼体时期时，开始投喂牟氏角毛藻(Chaetoceros muel-leri)，起始投喂量为每日 2 000 cells/mL，通过光学显微镜观察幼体胃部饱满情况并逐渐增加投喂量。二腕幼体至四腕幼体时期，每日投喂量为3 5008 100 cells/mL;六腕幼体至八腕幼体时期，每日投喂量逐渐增加至 12 500 20 000 cells/mL。在浮游幼体培育过程中，幼体密度约为0.5 枚/mL，此时空间适宜，成活率较高。室内水温保持在 2223.3，盐度保持在 2932，养殖池中 24 h 微充气。在幼体发育期间，通过光学显微镜观察幼体发育过程，并用电子设备进行拍照，观察记录胚胎和幼体的发育特征及时间，测量相关时期特征数据。各期胚胎和幼体发育时间以随机样本中出现该时期50%的个体为标准。1.2.5稚胆培育八腕幼体变态成为稚胆后，管足开始伸出，此时将培育好的波纹板放入稚胆池中，稚胆通过管足附着在硅藻板上，开始摄食底栖硅藻，纤毛带上的纤毛活动逐渐减弱。每日换水一次，换水量为 1/2，保持水质清洁，自然光照，微充气。随着稚胆的生长，开始投喂海带、裙带菜和石莼，每日一次，及时查看，保证海胆的摄食充足。此时进行网箱养殖，将相同大小的同家系海胆置于同一个网箱，以防止因食物竞争导致海胆生长差距过大。另外，仍需防范病害的发生，防止弧菌等病菌滋生，并加强人工管理，勤换水，或进行流水养殖。波纹板附着基的培育:先将水泥池消毒，取潮间带底栖硅藻，用孔径为 50 m 的筛绢网反复筛取后加入池水中，再加入用硅酸钠、过磷酸钙和硫酸铵配制的营养盐，将消毒后的波纹板放入池中，充气，每隔两天换水一次，如有桡足类等敌害生物发生，可加入敌百虫等药物控制。1.2.6人工繁育 3 龄海胆生长指标及性腺指数的测定将繁育的稚胆继续在实验室养殖 3 年。于2022 年7 月9 日开始，一周内先后取 3 批3 龄海胆样本，包括产卵的 51 枚和未产卵的 39 枚，每批样本 30 枚。先称量每一枚海胆的活体质量，取其平均值，然后解剖取其性腺，称量湿性腺质量，取其平均值，再计算每一批海胆的性腺指数(IGS)，即IGS=湿性腺质量/活体质量100%。1.3数据处理试验数据以平均值标准差(meanS.D.)表示，采用 SPSS 软件进行单因素方差分析，显著性水平设为 0.05。2结果与分析2.1亲胆促熟效果在亲胆促熟过程中，一般来说，体积越大的海胆性腺发育越好。壳径在 2 cm 以上的哈氏刻肋海胆产卵量较大。给亲胆注射 KCl 溶液 1.5 5 min后，雌性海胆开始产卵，在灯光下可见卵透明且呈细小球状体;雄性海胆开始排精，精液为白色乳状液体。说明亲胆催熟效果较好。2.2人工催产及受精卵观察在 23.7 水温下，给哈氏刻肋海胆亲胆注射KCl 溶液 1.55 min 后，亲胆开始产卵、排精。亲胆在产卵、排精时，管足不停摇摆，生殖孔周围的棘在无规则摆动，所排出的精子和卵细胞呈细线状342第 2 期洪继彪，等:哈氏刻肋海胆胚胎、幼体发育及人工养殖从多个生殖孔排出，随之在海水中散开。2018 年9 月5 日共催产 10 枚亲胆，其中 4 枚亲胆产卵，在5 倍显微镜下可见均黄卵(图 2(a)，带有极体，易沉，在灯光下可见细小透明球体;3 枚亲胆产精子，为细线状乳白色液体，排入水体后散成雾状，在 40 倍显微镜下可见精子呈带有长尾的类似锥形体(图 2(b)，精子活性好，不停地无规则游动。取适量精子倒入卵子中进行授精，10 min左右后在 5 倍镜下可见卵膜(图 2(c)，每枚卵子周围有 35 个精子不停游动;受精卵色泽淡黄，外形饱满，无不规则卵，卵膜无破损;受精率较高，为 90.6%96.4%，平均为 93.6%2.1%。在此后又催产 3 次(表 1)，每次解剖催产成功的亲胆和未产卵的海胆共 30 枚，观察其性腺发育情况。PB极体;UE未受精卵;T尾;H头;N颈;A顶体;EM卵膜。PBpolar body;UEunfertilized egg;Ttail;Hhead;Nneck;Aacrosome;EMegg membrane图 2哈氏刻肋海胆的生殖细胞和受精卵Fig.2Germ cells and fertilized egg of Temnopleurushardwickii表 1哈氏刻肋海胆的催产、受精及孵化Tab.1Induced to spawn，fertilization and incubation of the Temnopleurus hardwickii日期data水温/temperature催产数/枚induced spawningindividual催产率/%success rate产卵量/万粒fecundity受精率/%fertilization孵化密度/(ind.mL1)incubation density孵化水温/incubationtemperature催产方式inducedspawning2018-09-0523.7107021.7396.4152324KCl 溶液2018-09-1222.1106015.5095.61222.4KCl 溶液2018-09-2621.710305.6390.610220KCl 溶液2022-07-0919.1105013.5595.41220.1KCl 溶液2.3胚胎发育过程1)卵与受精卵。哈氏刻肋海胆成熟卵细胞卵径为(131.013.9)m，呈淡黄色，当水中不充气时，卵子易沉于水，属于均黄沉性卵。卵呈椭圆形，光 学 显 微 镜 下 卵 膜 明 显，且 具 有 卵 膜 孔(图 3A)。精子进入卵细胞后，卵细胞周围形成一层受精膜，受精卵卵径为(132.71 4.68)m(图 3B，表 2)。2)卵裂期。受精卵经 50 min 左右进入卵裂期。受精卵开始辐射型卵裂，卵细胞中部向内凹陷，分裂成两个相似大小的细胞(图3C)，第一次卵裂 20 min 后进入第二次卵裂，受精卵分裂成4 个相似大小的细胞(图 3D)。此后每经 30 min 进行一次卵裂，历经 8 细胞期(图 3E)、16 细胞期(图3F)。3)囊胚期。受精卵历经约 5 h 进入囊胚期(图 3G)。囊胚期胚胎是由少数几层细胞围成的中空球体，胚胎长度为(121.693.61)m(表2)，约 2 h 后，囊胚脱去卵膜，开始在水中自主旋转。4)原肠期。受精卵经过 10 h 发育后，胚胎进入原肠期(图 3H)。原肠期胚胎长度为(139.539.03)m(表 2)。原肠期开始时，囊胚植物极出表 2哈氏刻肋海胆的胚胎和幼体发育过程Tab.2Embryonic and larval development process of Tem-nopleuru