鳜仔稚鱼牙齿发育和矿化过程观察_曹林军.pdf

第 38 卷第 1 期大 连 海 洋 大 学 学 报大 连 海 洋 大 学 学 报Vol.38 No.12 0 2 3 年 2 月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITYFeb.2 0 2 3DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2022-102文章编号:2095-1388(2023)01-0051-08鳜仔稚鱼牙齿发育和矿化过程观察曹林军,赵金良,徐俊,张琦,陈铭(上海海洋大学 农业农村部淡水水产种质资源重点实验室,水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心,水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306)摘要:为了解鳜(Siniperca chuatsi)牙齿的早期发育和矿化过程,采用解剖镜和光学显微镜技术观察了孵化后 155 d 仔稚鱼牙齿出现时间、列数和数目变化,通过软骨-硬骨染色、Von Kossa 染色观察了牙齿矿化时间,采用 X 射线能谱仪测定了牙齿矿化过程中钙、磷元素含量的变化,采用免疫组化方法观察了碱性磷酸酶蛋白表达变化,并用荧光定量 PCR 方法检测了细胞间隙连接蛋白 43(Cx43)和钙结合蛋白-d28k(CaB)基因表达量变化。结果表明:孵化后 3 d 时鳜颌齿出现,5 d 时咽齿出现,8 d 时腭齿出现,12 d 时犁齿出现;孵化后 8 d 时下颌齿列数发育完全,11 d 时上颌齿列数发育完全;颌齿中,绒毛状齿先发育,犬齿孵化后 18 d 开始发育;牙齿矿化时间为孵化后 1114 d,矿化过程中钙、磷元素含量显著增加(P0.05);孵化后 10、12 d 时,碱性磷酸酶蛋白在牙釉质、牙本质中呈阳性反应;Cx43 和 CaB 基因相对表达量均在孵化后 10、12 d 时有升高,仅 CaB 基因显著上升(P0.05),14 d 时两基因均显著下降(P0.05)。研究表明,鳜早期牙齿出现,能直接咬住、固定活饵鱼,防止其逃脱,而钙、磷元素和矿化相关蛋白均参与了牙齿矿化过程。关键词:鳜;牙齿;发育;矿化中图分类号:S 917.4 文献标志码:A 牙齿是鱼类重要的摄食器官,其发生是由上皮-间充质相互作用,经细胞分化、形态发生、组织矿化和牙萌出等的复杂生物学过程1-2。其中,矿化是牙齿硬组织发育的重要事件,其主要为羟基磷灰石晶体形成的过程3。而许多矿化蛋白,如牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein,DPP)、牙本质基质蛋白(dentin matrix protein 1,DMP 1)、牙釉 蛋 白(enamelin)、细 胞 间 隙 连 接 蛋 白 43(connexin 43,Cx43)、钙结合蛋白-d28k(Calbi-ndin-d28k,CaB)等在羟基磷灰石结晶的形成和生长中起重要作用4-5。鳜(Siniperca chuatsi)是中国传统的淡水名贵经济鱼类6,终生以活鱼、虾为饵,是典型的肉食性鱼类,牙齿尤其发达7。前期,作者对鳜口腔齿形态学特征进行了详细观察,发现鳜具有上颌齿、下颌齿、犁齿、腭齿和咽齿。其中,颌齿具34 列,且有犬齿特化,犁齿、腭齿和咽齿均为绒毛状齿,牙齿呈圆锥状,朝口咽腔内弯曲8。鳜鱼苗一般在孵化后 34 日龄(混合营养期)开口,以活鱼鱼苗为食9,因此,牙齿发育是仔鱼成功捕食的必要条件;同时,鳜在早期发育阶段,还会经历捕食方式的转变(从饵料鱼尾部捕食转向从头部捕食)10-11。田文斐12初步观察了鳜早期阶段颌齿、咽齿、腭齿和犁齿的出现次序,但未对其牙齿列数与数目变化、犬齿与绒毛状齿分化等进行全面观察;此外,对鳜牙齿矿化作用与相关矿化蛋白的研究尚未见报道。本研究中,通过软骨-硬骨染色、组织切片等多种方法,全面描述了鳜仔稚鱼期齿列数与数目的变化特征、矿化发育过程、钙磷元素含量变化,以及碱性磷酸酶蛋白、Cx43、CaB 基因表达量的变化特征,以期为鳜摄食适应研究提供基础资料。1 材料与方法1.1 材料鳜仔稚鱼样本采集于上海市浦东新区孙农水产养殖场。鳜雌、雄亲鱼经人工催产、授精后,受精 收稿日期:2022-04-07 基金项目:财政部和农业农村部:国家现代农业产业技术体系资助(CARS-46)作者简介:曹林军(1997),女,硕士研究生。E-mail:2302503683 通信作者:赵金良(1969),男,教授。E-mail:jlzhao 卵于孵化桶中自然孵化,水温为 2325。以团头鲂(Megalobrama amblycephala)鱼苗为开口饵料,后期投喂合适的草鱼(Ctenopharyngodon idel-lus)鱼苗。连续采集孵化后 1 55 日龄的鳜仔稚鱼,每天随机抽取 50100 尾,分别保存于 4%福尔马林、4%多聚甲醛(均为体积分数,下同)和Bouins 液中,用于软骨-硬骨染色、免疫组化和组织切片等分析;每天另取 3050 尾,放入液氮罐内速冻后置于-80 超低温冰箱中保存,用于荧光定量 PCR 试验。为减少误差,本试验样品为同一批受精卵在同一孵化桶孵化的仔稚鱼。1.2 方法1.2.1 软骨-硬骨染色取孵化后 155 d 的鳜仔稚鱼(每天取 6 尾),用 4%福尔马林固定 24 h,采用 Dingerkus 等13的软骨-硬骨(阿尔新兰-茜素红)双染色技术对鱼体进行染色,记录牙齿数目、列 数 变 化 和 矿 化 时 间。在 Nikon 解 剖 镜(SMZ1500)下观察并拍照,采用 Photoshop 6.0 软件对拍摄的图片进行编辑处理。1.2.2 组织切片取孵化后 155 d 仔稚鱼牙齿(每天取 6 尾),用 Bouins 液固定 24 h,其中 1 15 d 的仔鱼取整鱼作为样品,1655 d 的稚鱼取头部作为样品。常规石蜡包埋组织切片14,用 Leica RM 2016 型切片机进行横切和纵切,厚度为 7 m,再用苏木精-伊红(HE)染色、中性树脂封片,在Nikon 显微镜(ECLIPES 80i)下观察并拍照。1.2.3 Von Kossa 染色取孵化后 155 d 仔稚鱼(每天取 6 尾),用 4%多聚甲醛固定 24 h,其中115 d 的仔鱼取整鱼作为样品,1655 d 的稚鱼取头部作为样品。常规石蜡包埋组织切片14,采用孙崇然等15的 Von Kossa 染色技术对鱼体进行染色,在 Nikon 显微镜(ECLIPES 80i)下观察并拍照。1.2.4 钙、磷元素含量分析取孵化后 10、12、14 d 的仔稚鱼牙齿(每天取 3 尾,每尾取 3 颗),37 下干燥 24 h,在牙齿表面镀金后,采用 Aztec X-Max80 型 X 射线能谱仪(上海交通大学分析测试中心),在牙齿表面随机取 3 个点测试,分析钙、磷元素含量。1.2.5 免疫组化 取孵化后 10、12、14 d 的仔稚鱼全鱼(每天取 3 尾),用 4%多聚甲醛固定 24 h。常规石蜡包埋组织切片14,采用碱性磷酸酶一抗和二抗试剂盒(均购自上海优宁维生物科技有限公司)测定牙齿中碱性磷酸酶蛋白的表达,对照组不加碱性磷酸酶一抗,其他步骤均相同,最后在Nikon 显微镜(ECLIPES 80i)下观察并拍照。1.2.6 荧光定量 PCR 取-80 冰箱中保存的 2、10、12、14 d 的仔稚鱼(每天取 6 尾),采用宋银都等16的荧光定量 PCR 技术测定仔稚鱼全鱼中Cx43 和 CaB 基因的表达量。以 2 d 仔鱼为对照,采用 2-Ct法计算目的基因的相对表达量。根据本实验室鳜转录组数据(未发表),采用PrimerExpress 5.0 软件设计 Cx43、CaB 和-actin基因的引物序列(表 1),引物由金维智(苏州)生物科技有限公司合成。根据所设计的引物,以-actin 为内参基因进行荧光定量 PCR。反应体系(20 L):TB Green Premix Tap 10 L,正、反引物各 0.8 L,cDNA模板1.6 L,无菌水6.8 L。反应程序:95 下预变性30 s;95 下变性5 s,58 下退火30 s,共进行 40 个循环;95 下变性 10 s,65 下退火 5 s。表 1 鳜牙齿矿化相关基因的引物序列Tab.1 Primer sequence of tooth mineralization gene of Si-niperca chuatsi基因 gene引物序列 primer sequence(5-3)Cx43F:AGCCCCACCCCTAAAGAACT R:TGCTCTGTGGAGTAGTTGGCCaBF:ATGGAAAGTTGGGCCTGTCAR:GGTAGAGCTTCCCTCCGTCA-actinF:ATCGCCGCACTGGTTGTTGACR:CCTGTTGGCTTTGGGGTTC1.3 数据处理试验数据均以平均值标准差(meanS.D.)表示。采用 SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),用 Duncan 法进行组间多重比较,显著性水平设为 0.05。2 结果与分析2.1 仔稚鱼期牙齿发育时序2.1.1组织切片观察孵化后 3 d 时颌齿出现(图 1A),5 d 时咽齿出现(图 1B),8 d 时腭齿出现(图 1C),12 d 时犁齿出现(图 1D)。2.1.2 软骨-硬骨染色观察 孵化后 3 d 时颌齿出现(图 2A),8 d 时腭齿出现(图 2B),12 d 时犁齿出现(图 2C)。2.2 仔稚鱼期牙齿列数与数目的变化2.2.1 颌齿列数 颌齿列数由中间向内、外两侧25大连海洋大学学报 第 38 卷A孵出后 3 d 上颌齿;B孵出后 5 d 咽齿;C孵出后 8 d 腭齿;D孵出后 12 d 犁齿。Mt上颌齿;Pht咽齿;Pt腭齿;Vt犁齿。Amaxillary tooth at 3 days post hatch(dph);Bpharyngeal tooth at 5 dph;Cpalatal tooth at 8 dph;Dvomerine tooth at 12 dph.Mtmaxillary tooth;Phtpharyngeal tooth;Ptpalatal tooth;Vtvomerine tooth.图 1 仔稚鱼期鳜牙齿组织切片Fig.1 Histological section of tooth of Siniperca chuatsi at the early stage发育。上颌齿:孵化后 3 d 时中间内列出现,4 d时中间外列出现,8 d 时最外列出现,11 d 时最内列出现。下颌齿:孵化后 3 d 时中间列出现,4 d时内列出现,8 d 时外列出现(表 2)。2.2.2 牙齿数目 颌齿发育过程中,前端先发育,后端晚发育;绒毛状齿先出现,在孵化后 18 d 时犬齿开始出现,刚出现的犬齿大小和绒毛状齿基本一致,孵化后 30 d 时二者有明显的区别(表 3)。A孵化后 3 d 下颌齿;B孵化后 8 d 腭齿;C孵化后 12 d犁齿。Mt下颌齿;Pt腭齿;Vt犁齿。Amandibular tooth at 3 days post hatch(dph);Bpalatal tooth at 8 dph;Cvomerine tooth at 12 dph.Mtmandibular tooth;Ptpalatal tooth;Vtvomerine tooth.图 2 仔稚鱼期鳜牙齿软骨-硬骨染色Fig.2 Cartilage-bone staining of tooth of Siniperca chuatsi at the early stage表 2 仔稚鱼期鳜颌齿列数的变化Tab.2Change in jaw tooth column number of Siniperca chuatsi at the early stage孵化后日龄/d day post hatch列数 column number 上颌齿 maxillary tooth下颌齿 mandibular tooth3114228331143 腭齿先前端发育,逐渐往后端发育;