旱胁迫相关绿豆VrERF家族基因发掘及表达分析_李蒙鑫.pdf

第 41 卷 第 2 期2023 年 4 月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.41 No.2Apr.2023旱胁迫相关绿豆VrERF家族基因发掘及表达分析李蒙鑫1，丁冬会1，张雨朋1，景琳超1，鲁建荣1，刘嘉斐2，陈吉宝1，杨树琼1*（1.河南省南水北调中线水源区生态安全重点实验室，河南 南阳 473061；2.河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，河南 南阳 473061）摘要：【目的】探究AP2/ERF转录因子在绿豆干旱胁迫响应中的应答机制。【方法】基于全基因组测序数据对绿豆VrERF家族基因的种间同源性、互作蛋白功能及顺式作用元件进行分析，通过转录组测序数据分析各VrERF基因的组织特异性表达、干旱胁迫下基因表达差异情况并用qRT-PCR进行验证。【结果】绿豆与豌豆、菜豆和大豆的ERF家族基因间不仅具有相同的进化起源，还存在明显的基因扩张现象。VrERF基因启动子区均具有多个与激素响应、胁迫响应以及生长发育相关的顺式作用元件。此外，不同的绿豆VrERF蛋白间存在广泛的互作关系，可能通过与bZIP、RAP2.4和STZ等蛋白互作参与绿豆非生物胁迫的防御响应。基因表达分析显示，多数VrERF家族基因的表达具有较强的组织特异性，且在干旱胁迫下，VrERF7/62在绿豆VC1973A和JP226873叶片中均显著下调表达，qRT-PCR检测也显示VrERF7/62的表达受干旱胁迫诱导显著下调。【结论】推测VrERF7/62可能在绿豆干旱胁迫响应过程中起负调控作用，结果也为绿豆AP2/ERF家族基因的抗逆性表达及基因功能研究奠定了基础。关键词：绿豆；AP2/ERF基因家族；干旱胁迫；表达模式中图分类号：S522 文献标志码：A 文章编号：1000-2650（2023）02-0287-08Identification and Expression Analysis of Drought Stress-Related VrERF Gene Family in Mung BeanLI Mengxin1，DING Donghui1，ZHANG Yupeng1，JING Linchao1，LU Jianrong1，LIU Jiafei2，CHEN Jibao1，YANG Shuqiong1*（1.Key Laboratory of Ecological Security for Water Source Region of Mid-Line of South-to-North Diversion Project of Henan Province，Nanyang 473061，Henan，China；2.Henan Key Laboratory of Insect Biology in Funiu Mountain，Nanyang 473061，Henan，China）Abstract:【Objective】In order to explore the response mechanism of AP2/ERF transcription factor in mung bean under drought stress.【Method】The interspecies homology，interacting protein function and cis-acting elements of VrERF family genes in mung bean were analyzed based on the whole genome sequencing data.The tissue-specific expression of each VrERF gene and the difference of gene expression under drought stress were analyzed by transcriptome sequencing data and verified by qRT-PCR.【Result】The ERF family gene of mung bean had that same evolutionary origin as those of pea，kidney bean and soybean，and also had obvious gene expansion.The promoter region of VrERF gene has many cis-acting elements related to hormone response，stress response and growth.In addition，there are extensive interactions among different VrERF proteins in mung bean，which may participate in the defense response of mung bean to abiotic stress through interaction with bZIP，RAP2.4 and STZ.Gene expression analysis shows that the expression of most VrERF family genes has strong tissue specificity，and VrERF7/62 is significantly down-regulated in mung bean VC1973A and JP226873 leaves under drought stress.doi：10.16036/j.issn.1000-2650.202211170收稿日期：2022-11-06基金项目：河南省科技攻关专项（222102110275）；南阳师范学院博士科研专项（2019ZX027）；南阳师范学院研究生创新基金项目（2021CX010）；河南省高等学校大学生创新训练计划项目（202210481023）。作者简介：李蒙鑫，硕士研究生。*责任作者：杨树琼，博士，讲师，主要从事食用豆类作物遗传育种与种质创新研究，E-mail：。四川农业大学学报第 41 卷 qRT-PCR analysis also showed that the expression of VrERF7/62 was significantly down-regulated by drought stress.【Conclusion】This study speculated that VrERF7/62 might play a negative role in the response to drought stress in mung bean，and laid a foundation for the study of the expression and gene function of AP2/ERF family genes in mung bean.Keywords:mung bean；AP2/ERF gene family；drought stress；expression pattern绿豆（Vigna radiate(L.)Wilczek），别名菉豆、植豆等，是我国重要的粮食经济作物，在中国已经有两千多年的栽培历史。绿豆在生长过程中始终处于一种土壤条件，不可自行移动，具有固定性，其在整个生长发育过程中非常容易遭受干旱、盐碱和低温等非生物胁迫影响1。干旱胁迫不仅是限制绿豆生命活动的限制因子，也是决定其地理分布及限制其产量的主要因素2。部分绿豆具有一定的抗旱能力，但是在长期干旱的地区，需要为其定期补充水分，否则会对绿豆产量造成一定的影响。目前国内种植主要集中在北方，内蒙古、吉林和黑龙江等省份干旱贫瘠的山区丘陵地带3，且大部分绿豆产区自然降雨量少，灌溉条件差。有研究表明，干旱胁迫会对绿豆的光合作用产生抑制作用，光化学效率降低导致光能过剩，其光合器官会因此遭到破坏2。而且随着干旱胁迫程度的增加，绿豆苗期的植株光合速率、蒸腾速率和气孔导度都会逐步减弱，并且这些指标相互之间呈现显著的正相关，随着干旱胁迫时间的增加，叶绿素含量和叶片的含水量呈现低高低这样的一个变化趋势，进而影响绿豆种子的品质以及产量4。干旱胁迫不仅会影响植物的形态建成5，还会诱导植物相关基因的表达调控，对其作出反应的主要调控基因就是转录因子。作为植物体内广泛存在的超大转录因子家族之一，AP2/ERF转录因子最先在拟南芥中被发现6，依据所含的AP2/ERF结构域个数及其结构域同源性，将拟南芥AP2/ERF转录因子分为5个亚家族：AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist。AP2/ERF家族基因功能也呈现多样化，研究发现AP2/ERF家族参与了植物的高温、干旱、盐碱以及机械损伤等非生物逆境响应过程7-8。AP2/ERF转录因子可通过调节下游基因或相互合作来抵抗干旱胁迫，过表达ZmERF21显著增加了玉米叶绿素含量和抗氧化酶活性，并通过调节激素信号和胁迫应答基因的表达来增强玉米幼苗的耐旱性9。水稻 OsERF83 可调控旱胁迫相关基因的表达，过表达OsERF83显著提高了水稻的耐旱性10。大豆GmDREB8可负向调控植物的耐旱能力，异源表达GmDREB8转基因拟南芥比野生型对干旱胁迫更敏感，而大豆GmDREB8沉默株系表现出更强的耐旱性11。水稻OsERF3基因含有EAR抑制结构域基序，对干旱胁迫起负调控作用12。上述研究表明，AP2/ERF转录因子在植物应对干旱胁迫的分子调控机制中起着至关重要的作用。AP2/ERF转录因子对研究植物响应逆境胁迫生理过程具有十分重要的价值，然而目前为止，对绿豆AP2/ERF家族基因的逆境响应及表达调控机制研究较少。本课题组前期已筛选到 87 个绿豆VrERF家族基因，并对其结构特征、理化性质等进行了初步分析。为进一步探究VrERF家族基因在绿豆逆境胁迫中的应答机制，本研究对VrERF家族基因的种间同源性、互作蛋白功能及顺式作用元件进行了预测分析，并通过转录组测序数据分析了各VrERF基因的组织特异性表达、干旱胁迫下基因表达差异情况，筛选了2个与干旱胁迫相关的VrERF基因并进行了qRT-PCR验证。此研究将为进一步开展干旱胁迫相关基因的功能分析奠定了基础，也将为利用转录调控、基因育种等手段培育绿豆抗逆新品种提供理论依据。1材料和方法1.1绿豆VrERF家族基因的种间同源性、互作蛋白功能预测与启动子区顺式作用元件分析绿豆、豌豆、菜豆与大豆的基因组及转录组数据下载自 NCBI-genome（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/）和PlantBioinfoPF（https：/urgi.versailles.inra.fr/Species/Pisum），各物种间全基因组比对、ERF家族基因间的共线性可视化使用Java环境下的MCScanX和TBtools软件进行分析。VrERF蛋白互作网络分析使用 String 蛋白互作数据库（http：/string-db.org/），物种参数选择模式植物拟南芥。使用TBtools提取VrERF家族基因起始密码子上游2 000 bp序列，启动子区顺式作用元件预测分析使用在线软件 PlantCARE(http：/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，各顺式作用元件的可视化分析使用TBtools进行。288第 2 期李蒙鑫，等：旱胁迫相关绿豆VrERF家族基因发掘及表达分析1.2绿豆VrERF家族基因的组织特异性表达、干旱胁迫下的表达及验证分析从NCBI-SRA（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）