贵州山茶花灰斑病葡萄牙拟盘...毛孢菌的生物学特性研究初报_龙海江.pdf

广西植保2023年第1期GUANGXI PLANT PROTECTION 2023，Vol.36No.1贵州山茶花灰斑病葡萄牙拟盘多毛孢菌的生物学特性研究初报龙海江，樊娟*（贵阳人文科技学院贵州贵阳550025）摘要：为明确贵州省山茶花葡萄牙拟盘多毛孢菌灰斑病（Pestalotio psisportugalica）病原的生物学特性，针对从种植地采集感病样品中分离出的菌株（编号为schb1），研究碳源、氮源、pH、温度和光照对病原菌菌丝生长的影响。结果表明，该菌菌丝最适生长温度为25，最适pH值为6，对碳源蔗糖、氮源酵母膏的利用最高，菌丝生长对光暗交替敏感。研究结果为进一步了解山茶花葡萄牙拟盘多毛孢菌灰斑病发生规律和开展病害综合防治提供了重要参考。关键词：山茶花；灰斑病；葡萄牙拟盘多毛孢菌；生物学特性中图分类号：S436.8文献标志码：B文章编号：1003-8779（2023）01-0014-05山茶花（Camellia sp.）为山茶科山茶属植物，又名茶花、小茶花、山茶和耐冬等，是我国集药用和观赏于一身的经济价值较高的传统十大名花之一1。医学研究发现，山茶花作为蒙药被收载在 中华人民共和国卫生部药品标准蒙药分册 中，其具有治疗安希拉、清热解毒、消除刺痛和治牙痛的作用2-3，山茶花提取物具有止血、治疗烫伤和保护胃黏膜的功效4。此外，山茶花的花色鲜艳，季相变化丰富，具有较高的观赏价值5。葡萄牙拟盘多毛孢菌（Pestalotio psisportugalica）的菌丝生长与温度、光照、基质pH及营养成分等条件密切相关，开展葡萄牙拟盘多毛孢菌生物学特性研究是掌握其所致病害发生规律和制定有效防控措施的重要基础。据文献查找结果，关于葡萄牙拟盘多毛孢菌生物学特性方面的研究尚未见于报道。本研究经过田间调查发现，山茶花灰斑病在种植区域均有发生，是山茶花病害中最严重的一种。为了解山茶花灰斑病病原特性，有针对性地开展病害防控，本研究于2021年12月在贵州贵阳市一种植区域采集山茶花灰斑病样品并从中分离获得致病葡萄牙拟盘多毛孢菌，探索不同温度、培养基pH、光照、碳源和氮源对菌丝生长的影响，旨在探明山茶花灰斑病病原的生物学特性，以期获得菌株最适宜的培养条件，明确菌株对环境条件要求的差异性，为更好地进行病原培养，了解当地山茶花灰斑病病害的发生、流行规律和综合防治研究提供一定的理论依据。1材料与方法1.1材料感病样品：供试病叶为杜鹃红山茶花叶片，采自贵州省贵阳市一种植区域，选取10片带有典型病症的叶片用无菌剪刀从叶柄部位剪下，放置于无菌封口袋中保存，带回实验室分离培养。供试菌株：由笔者分离培养得到，通过形态学鉴定、分子生物学鉴定、柯赫氏法则和系统发育树分析，将其鉴定为葡萄牙拟盘多毛孢菌，这与张晓勇等人6分离的山茶灰斑病的致病菌一致。供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。收稿日期：2022-03-15基金项目：贵阳人文科技学院基金项目“山茶花灰斑病的发生规律及诊断研究”（2021rwjs033）。作者简介：龙海江（1995-），男，贵州平坝县人，助教，研究方向为植物病害及防控。E-mail：。*通信作者：樊娟（1996-），女，贵州毕节市人，助教，研究方向为资源利用与植物保护。E-mail：。142023年第1期广西植保GUANGXI PLANT PROTECTION 2023，Vol.36No.11.2方法1.2.1病原菌对碳源、氮源的利用参考已有研究方法测定病原菌对碳源、氮源的利用特性7，选用乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉为碳源，酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠为氮源，以察氏培养基为基础培养基，用等质量的碳源及氮源分别替换基础培养基中的蔗糖和硝酸钠，以不含碳氮源的培养基为对照，取直径5mm病原菌菌饼接种于各培养基中央，25 恒温培养；所有处理均重复3次，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。1.2.2不同pH值对病原菌菌丝生长的影响用1 mol/L的HCL和1 mol/L的NaOH溶液调节PDA培养基的pH值为4、5、6、7、8、9、10共7个处理，取5 mm的菌饼接种于不同pH的PDA培养基平板中央，于25 下恒温培养，每个处理重复3次，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。1.2.3不同温度对菌丝生长的影响取直径5 mm病原菌菌饼接种于PDA培养基中央，分别将平板放在设置为不同温度（5、10、15、20、25、30、35、40）的恒温培养箱中培养，每个处理3次重复，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。1.2.4不同光照对菌丝生长的影响取直径5 mm菌饼接种至PDA平板中央，置于完全黑暗、12 h明暗交替和完全光照3个处理条件下，于25 恒温培养，每个处理3次重复，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。1.3 数据分析采用DPS 7.0数据处理软件进行显著性分析，采用Excel 2010统计做表，采用邓肯式新复极差法进行多重比较。2结果与分析2.1病原菌对碳源的利用如图1所示，在供试碳源培养基中，病原菌在25 恒温培养均能生长，对蔗糖利用最好，培养5 d后菌落直径为56.33 mm，生长速率达11.27 mm/d；在以麦芽糖、可溶性淀粉和葡萄糖为碳源的培养基上次之，生长速率分别为10.81 mm/d、10.73 mm/d 和10.57 mm/d，三者无显著差异；以乳糖为碳源时菌丝生长缓慢，生长速率仅为7.23 mm/d。6050403020100ABbABbBbAaCcDd菌落直径（mm）麦芽糖可溶性淀粉乳糖葡萄糖蔗糖对照碳源图1不同碳源对山茶花灰斑病菌菌落直径的影响以上数据上标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01）。下图同。2.2病原菌对氮源的利用如图2所示，在病原菌对氮源的利用试验中，山茶花灰斑病病原菌在不同氮源培养基上均能生长。其中在以酵母膏为氮源时，其菌丝生长最快，菌落直径为61.57 mm，生长速率为12.31 mm/d；以蛋白胨为氮源时次之，生长速率为11.85 mm/d；在硫酸铵培养基上最慢，生长速率仅为7.13 mm/d。致病菌在不同氮源培养基上菌丝丰度差异不大，而在不含氮源的培养基（CK）上菌丝稀疏，生长缓慢。15广西植保2023年第1期GUANGXI PLANT PROTECTION 2023，Vol.36No.1706050403020100CdDeCcAaBbEf菌落直径（mm）硝酸钠硫酸铵蛋白胨硝酸铵酵母膏对照氮源图2不同氮源对山茶花灰斑病菌菌落直径的影响2.3不同pH值对病原菌菌丝生长的影响如图3所示，病原菌有较宽的酸碱度适应范围，在pH值为410范围内均可生长，培养5 d后各处理间差异显著，且病原菌菌丝生长速度随pH值升高呈现一个先增加后降低的趋势。适宜病原菌生长的pH值为67，菌丝生长速率为15.3415.83 mm/d，二者差异不显著，在pH值为6时，菌丝生长最快，其菌落直径为79.17 mm，说明该致病菌对碱性环境具有一定耐受力，在酸性环境中生长速度相对较慢。9080706050403020100菌落直径（mm）pH45678910CcBbAaABabDaEeFf图3不同pH对山茶花灰斑病菌菌丝生长的影响2.4不同温度对病原菌菌丝生长的影响如图4所示，病原菌对温度的适应范围较宽，不同温度对病原菌菌丝生长具有显著影响，该病菌在10 35 均可生长，且病原菌菌丝生长速度随温度值升高也呈现先增加后降低的趋势。最适宜菌丝生长的温度为25，菌落直径为77.43 mm，生长速率达15.49 mm/d；培养温度低于10 或高于35 时菌丝生长受到明显抑制甚至停止生长。162023年第1期广西植保GUANGXI PLANT PROTECTION 2023，Vol.36No.19080706050403020100菌落直径（mm）温度（）510152025303540GgEeCcBbAaDdFfGg图4不同温度对山茶花灰斑病菌菌丝生长的影响2.5不同光照对病原菌菌丝生长的影响如图5所示，在PDA培养基上，病原菌在完全光照、完全黑暗、12 h光暗交替处理条件下培养5 d，各处理之间差异明显，以12 h光暗交替处理病原菌生长最好，菌落直径为77.97 mm，生长速率达15.59mm/d，其次是持续黑暗和持续光照，生长速率分别为14.97 mm/d和14.5 mm/d。全黑Bb菌落直径（mm）全光Cc光暗交替Aa80787674727068光照条件图5不同光照对山茶花灰斑病菌菌丝生长的影响3讨论拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis spp.）广泛分布于自然界中，兼寄生或腐生生活，是人类发现的重要植物病原菌之一，它可侵染多种植物造成各种类型的病害，从而严重影响作物的品质和产量，导致重大的经济损失。已有相关研究表明，拟盘多毛孢属能引起茶叶8-10、橡胶树11、中药材12-14、树莓15、高粱16等作物的病害，在农业生产上给我国造成严重的危害。本研究中分离的菌株最适生长温度和pH与邢勇等17报道的拟盘多毛孢属真菌基本保持一致。邢勇等报道茶褐斑拟盘多毛孢（Pestalotiopsis guepiniDesm）菌丝生长的最适碳源为葡萄糖和蔗糖，最适氮源为门冬酞胺、蛋白胨和酵母液，本研究中为蔗糖和酵母膏，这可能是因为供试碳源氮源不同或存在种间差异。4结论本研究对山茶花葡萄牙拟盘多毛孢菌灰斑病的生物学特性进行了初步研究，结果表明，该菌菌丝最适生长温度为25，最适pH值为6，以蔗糖和酵母膏为碳氮源时生长最好。目前，关于山茶花致病菌葡萄牙拟盘多毛孢菌的生物学特性鲜有报道，本研究初步明确山茶花的致病菌生物学特性，可为生产上防控山茶花病害奠定基础。17广西植保2023年第1期GUANGXI PLANT PROTECTION 2023，Vol.36No.1参考文献1张艳芳，屈爱桃山茶花的研究进展J中国民族医药杂志，2012，18(10)：41-442侯蕾，于大永，冯宝民，等西南红山茶花化学成分的分离与鉴定J时珍国医国药，2011，22(7)：1701-17033华青山茶花治牙痛J中国民间疗法，2002，10(5)：624怡悦山茶花的药理作用J国外医学(中医中药分册)，2002，24(5)：3165陈艺荃，潘宏，魏云华山茶花品种观赏性状的主成分分析与观赏价值综合评价J福建农业学报，2019，34(5)：551-5596张晓勇，李树江，王亮，等山茶灰斑病病原菌鉴定及防治药剂初步筛选J植物保护，2019，45(4)：209-215，2427张笑宇，孙雪梅，周洪友，等燕麦叶斑病病原菌鉴定及其生物学特性J植物保护学报，2017，44(3)：473-4808饶家瑞，周玉锋，张金锋，等抗茶轮斑病病原菌（Pestalotiopsis trachicarpicola）生物农药复配组合筛选J贵州农业科学，2021，49(8)：74-809李涛，尹桥秀，武娴，等余庆县茶叶斑病致病菌Pestalotiopsis trachicarpicola 鉴定及其生物学研究J中国植保导刊，2021，41(1)：24-30，2310张欣，卢声洁，程宇豪，等茶轮斑病病原菌Pestalotiopsis trachicarpicola 的生物学特性J贵州农业科学，2021，49(1)：38-4311时涛，李博勋，郑肖兰，等橡胶树新发拟盘多毛孢叶斑病的危害与防控对策J热带农业科学，2020，40(1)：1-612ZENG QING QIAN,HUANG HANQ IAN,LEI ZHOU XI,et al.First Report of Phomopsis Leaf Spot on PatchouliPogostemoncablin(Blanco)Benth.Caused by Diaporthe-arecae in ChinaJ.Agricultural Biotechnology,2020,9(2):14-15.13CHEN JIE,LIU XUE FENG,JIA HAN QI,et al.First report of leaf