骨髓间充质干细胞移植对正己...大鼠脊髓神经组织的修复作用_李思.pdf

论著论著DOI：10.11724/jdmu.2023.02.02骨髓间充质干细胞移植对正己烷中毒大鼠骨髓间充质干细胞移植对正己烷中毒大鼠脊髓神经组织的修复作用脊髓神经组织的修复作用李思1，孙经淞2（1.大连医科大学附属第一医院 检验科，辽宁 大连 116011；2.大连医科大学附属第一医院 创伤骨科，辽宁 大连116011）摘要目的探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植对正己烷中毒大鼠脊髓神经组织的修复作用。方法将健康成年雄性 SD 大鼠随机分成 5 组，每组 20 只。分别为：对照组（control）、干细胞对照组（BMSCs）、染毒组（HD）、自身修复组（HD+NS）和干细胞干预染毒组（HD+BMSCs）。对照组腹腔注射生理盐水，10 周后处死动物。BMSCs 组腹腔注射生理盐水 5 周后，行尾静脉干细胞移植术，5 周后处死动物。HD 组按 400 mg/kg 剂量，对大鼠腹腔注射 2，5-己二酮（2，5-hexanedione，HD），每周 1 次，持续注射 5 周后，处死动物。HD+NS 组对大鼠腹腔注射 HD 5 周后，经尾静脉注射生理盐水 1 mL，5 周后处死动物。HD+BMSCs 组对大鼠腹腔注射 HD 5 周后，经尾静脉行干细胞移植，5 周后处死动物。实验 5 周后观察大鼠的一般状态并进行步态评分。透射电镜观察处死后大鼠脊髓神经组织超微结构。MAP-2 和 SMI312 双标记免疫荧光染色和 LFB 染色观察大鼠脊髓神经组织轴突和髓鞘变化。结果HD+NS 组大鼠一般状态差、精神萎靡、无法站立、呈瘫痪状，步态评分为（40.38）分，属严重异常。HD+BMSCs 组大鼠在 BMSCs 移植 2 周后，大鼠精神状态明显提升、摄食量升高，随着移植时间的延长，大鼠步态逐渐改善。电镜结果显示，HD 中毒大鼠移植 BMSCs 后，脊髓神经组织可见新生轴突。SMI312 和 MAP2 免疫荧光双染可见，BMSCs 移植后神经元的 SMI312 免疫荧光强度明显增强。髓鞘LFB 染色结果显示 HD 中毒大鼠脊髓组织髓鞘脱失、板层疏松，而 BMSCs 移植后，大鼠脊髓神经组织髓鞘结构趋于正常。结论BMSCs 移植可显著改善 HD 中毒大鼠的神经行为、修复 HD 中毒大鼠脊髓神经组织受损的轴突和髓鞘。关键词正己烷；间充质干细胞；脊髓神经组织；移植中图分类号R994文献标志码A文章编号：1671-7295(2023)02-0106-07Repair effect on spinal cord nerve tissue of mesenchymal stem cellstransplant in hexane-poisoned ratsLI Si1,SUN Jingsong2(1.Department of Clinical Laboratory Medicine,the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China;2.Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Dalian MedicalUniversity,Dalian 116011,China)Abstract Objective To investigate the repair effect of transplantation of mesenchymal stem cells(BMSCs)on spinal cordnerve tissue in hexane-poisoned rats.Methods Healthy adult male SD rats were randomly divided into five groups of 20 ratseach:control group,BMSCs group,HD group,HD+NS group and HD+BMSCs group.In the control group,saline was injectedintraperitoneally;in BMSCs group,saline was injected intraperitoneally for 5 weeks,followed by tail vein stem celltransplantation for 5 weeks;in HD group,2,5-hexanedione(HD)400 mg/kg was injected once a week,intraperitoneally for 5weeks;in HD+NS group,HD was injected intraperitoneally for 5 weeks,followed by 1 mL of saline via tail vein for 5 weeks;in基金项目：辽宁省博士科研启动基金（2020-BS-193）第一作者简介：李 思（1994-），女，主管技师。E-mail：通信作者：孙经淞，副主任医师。E-mail：106李思，等：骨髓间充质干细胞移植对正己烷中毒大鼠脊髓神经组织的修复作用HD+BMSCs group,rats were injected with HD intraperitoneally for 5 weeks and then transplanted with stem cells through thetail vein for 5 weeks.The general status of the rats was observed and gait scores were performed after 5 weeks.The ultrastructureof rat spinal cord nerve tissue was studied by transmission electron microscopy,and immunofluorescence staining and LFBstaining were used to observe axonal and myelin changes in rat spinal cord nerve tissue.Results The rats in HD+NS groupshowed bad general status,depression,inability to stand,and paralysis,and the gait score was 40.38,indicating a seriousabnormality.After 2 weeks of transplantation,the status of the rats was significantly improved,the food intake was increased,and the gait gradually improved in association with time.Electron microscopic results showed that new axons were visible in thespinal cord nerve tissue of HD-intoxicated rats after transplantation of BMSCs.Double staining of SMI312 and MAP2immunofluorescence displayed that the SMI312 immunofluorescence intensity of neurons was significantly enhanced.LFBstaining showed myelin loss and laminar sparing in the rat spinal cord tissue,while myelin structure of the rat spinal cord nervetissue tended to be normal after transplantation of BMSCs.Conclusion BMSCs transplantation can significantly improve theneuro behavior and repair the damaged axons and myelin sheaths in the spinal cord of HD-intoxicated rats.Keywords n-hexane;mesenchymal stem cells;spinal cord neural tissue;transplantation正己烷（hexane）是一种广泛应用于工业的有机溶剂，长期接触正己烷将导致中枢和周围神经病变，表现为肢体远端逐渐麻木，肢体萎缩，甚至瘫痪1-2。2，5-己二酮（2，5-hexanedione，HD）是正己烷的内源性代谢物，已被确定为正己烷神经毒性的致病因素3-4。职业性正己烷中毒的报道在世界范围内多见，而在我国，群体性慢性正己烷中毒更是时有发生，已成为引起社会和媒体高度关注的严重的职业病之一。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新分化能力和多向分化潜能，且不受伦理学和来源限制的成体干细胞，已成为组织和器官修复学领域研究热点。骨髓间充质干细胞（bonemesenchymal stem cell，BMSCs）是干细胞家族的重要成员，其自我更新能力较强，兼具干细胞和基质细胞的特性，因其具有多向分化潜能、免疫调控和自我复制等特性而日益受到人们的关注。研究表明，MSCs移植可促进神经退行性疾病和脑血管疾病的神经组织 修 复，改 善 神 经 功 能 障 碍5。Jiang 等6报 道，BMSCs 可成功修复急性一氧化碳中毒大鼠的脑损伤，且明显改善大鼠的学习能力，预示了 BMSCs 干预将促使职业中毒所导致的受损神经功能恢复的可能性。本研究尝试利用正己烷中毒大鼠，采用尾静脉注射BMSCs，构建 BMSCs 移植 2，5-HD 中毒大鼠模型。通过神经行为学和病理形态学观察、免疫组织化学等检测分析，系统评价 BMSCs 移植对正己烷中毒大鼠脊髓神经组织轴突和髓鞘损伤的修复作用，探讨BMSCs 移植对正己烷中毒大鼠受损神经组织的保护作用。1材料和方法1.1材料45 周龄健康 SD 大鼠（大连医科大学动物实验中心）。实验过程中符合实验动物伦理原则。DMEM 培养基、胎牛血清（Gibco 公司）；胰蛋白酶、青霉素、链霉素（Sigma 公司）；MAP2 一抗（11 000）、Alexa Fluor594 标记驴抗兔 IgG 二抗（11 000）（Jackson，美国）；SMI312 一抗（12 000）（Biolegend，美国）；Alexa Fluor488 驴抗小鼠 IgG 二抗（11 000）（Jackson，美国）；MBP一抗（11 000）（Abcam，美国）；CD29-FITC（1100）、CD45-PE（1100）、CD90-PE（1100）（e-Biosciences，美国），DP72 倒置荧光显微镜（Olympus，日本）；TecnaiSpirit 透射电子显微镜（FEI，美国）。1.2方法1.2.1 BMSCs 分离、培养及鉴定：取 10 只 SD 大鼠（45周龄，雌雄不限），处死大鼠，75%乙醇浸泡 10 min。无菌条件分离并剪掉股骨及胫骨的骨骺端，用 PBS（含青、链霉素）反复冲洗骨髓腔，将收集到的骨髓细胞悬液移入无菌离心管，1 000 r/min 离心 5 min，用 DMEM培养液（含 10%胎牛血清）重悬管底压积细胞，以2109/cm2的细胞