镉对嗜热小球藻的毒性效应及生物富集研究_裴福文.pdf

引用格式：裴福文，谢作明，毛青，等镉对嗜热小球藻的毒性效应及生物富集研究安全与环境工程，（）：，（）：镉对嗜热小球藻的毒性效应及生物富集研究裴福文，谢作明，毛青，李鎏爽，钟兆淇，赵欣鑫（中国地质大学（武汉）环境学院，湖北 武汉 ；中国地质大学（武汉）生物地质与环境地质国家重点实验室，湖北 武汉 ）摘要：藻类在重金属生物修复中具有巨大的潜力，探究藻镉之间的相互作用，确定藻株性能，具有重要的意义。从矿区污染环境中筛选得到一株嗜热小球藻（），考察不同 浓度胁迫下嗜热小球藻的生理生化特性及其镉富集能力。结果表明：嗜热小球藻对 具有较强的耐受能力，嗜热小球藻的 半效应浓度（）为 ；随着 浓度的增加，小球藻细胞内的光合色素含量逐渐降低；在小球藻藻细胞内抗氧化系统中超氧化物歧化酶（）含量呈先增加后降低的趋势，浓度下小球藻藻细胞内抗氧化系统中 的含量最高，说明过高的 浓度会导致小球藻藻细胞抗氧化系统受损，而丙二醛（）含量逐渐增加，说明小球藻藻细胞损伤明显；小球藻对 具有较好的吸附性能，浓度下第天时小球藻对 的吸附效率可达 。可见，藻与镉之间存在相互作用，高浓度 会对嗜热小球藻的生长、光合系统及抗氧化系统造成一定的损害，但总体来看，嗜热小球藻耐镉性能较好，同时具有良好的镉生物富集能力。关键词：嗜热小球藻；镉；毒性效应；生物富集中图分类号：文章编号：（）收稿日期：开放科学（资源服务）标识码（）：基金项目：国家自然科学基金面上项目（、）；国家自然科学基金创新研究群体项目（）作者简介：裴福文（），男，硕士研究生，主要研究方向为环境生物地球化学。：通讯作者：谢作明（），男，博士，教授，博士生导师，主要从事土壤和地下水污染与防治、环境生物地球化学等方面的研究。：，（，（），；，（），）：，（），（），（），；（），第 卷第期 年月安 全 与 环 境 工 程 ，：；随着工业技术的不断发展，大量有毒有害的重金属离子进入环境中，给人类的生存与发展带来了巨大的危害。水环境中，镉（）主要以离子态、络合态、难溶悬浮态种形式存在，具有毒性高、难降解、迁移性强等特点。镉通过食物链进入人体，在体内积累，对人体的肾脏、骨骼、神经等系统造成毒害。天然水体中镉浓度约为 ，但在镉污染严重的水体中，其浓度高达 ，严重影响生态及人类安全。因此，如何降低水环境中的镉浓度，已成为当前环境科学领域的研究热点和难点。在自然界中，微藻广泛分布于水体及陆地生态系统中，可进行光合作用，吸收 ，释放，供给自身能量。微藻具有较大的比表面积，含有多种官能团，如、等，并有着较多的吸附位点、简单的营养特性和较好的重金属去除能力，同时还具有可被回收利用的绿色环保特性，故而在重金属生物修复中具有巨大的潜力。在污染水体中，大量的镉被吸附于藻细胞表面，同时少量的镉通过特定的离子通道进入藻细胞内，被液泡、叶绿体等细胞器所隔离。镉对微藻具有一定的毒害作用，在镉胁迫下藻细胞内可产生过量的活性氧（），破坏藻细胞内的氧化还原稳态，进而对微藻的生长代谢、形态结构、细胞器正常功能等造成严重的影响。但同时微藻对镉还具有一定的耐受性，通过其自身的抗氧化系统发挥作用，维护藻细胞的正常生长 。近年来，关于重金属镉与藻的相关研究主要集中于镉对藻的毒性效应或藻对镉的生物富集能力某一个方面，而系统地阐述藻镉的相互作用，探究镉对藻的毒性效应和藻对镉的生物富集能力，确定藻株性能，作为镉污染水体中镉去除的新选择，相关方面的研究还相对较少。同时，较多研究中所用藻均为模式藻株，在污染环境中适应性较差，而从污染环境中筛选得到的藻株因其强耐受性而更具有生物修复潜力。为此，本文以矿区污染环境中筛选得到的嗜热小球藻（）为研究对象，探究了不同 浓度胁迫下嗜热小球藻的生物量、半效应浓度（）、值、光合色素（叶绿素、叶绿素、类胡萝卜素）合成量、超氧化物歧化酶活性（）及脂质过氧化产物丙二醛（）活性等生理生化特性的变化，并考察嗜热小球藻对不同浓度 的吸附效率及吸附量，研究天然水体中藻镉的相互作用，探究镉对藻的毒性效应、藻的耐镉性能及对镉的生物富集能力，可为镉污染水体中镉的去除提供新的见解。材料与方法1.1试验材料试验所用嗜热小球藻（）由本实验室团队于石门矿区重金属污染土壤中筛选得到。经分离纯化，并进行鉴定，结果显示该藻种与嗜热小球藻亲缘关系最近，序列比对的一致度（）达到 ，见表。表纯化藻种 数据库亲缘关系表 类型最大结果数总数覆盖率值相似度序列号嗜热小球藻（）株 核糖体基因部分序列 将藻种置于 培养基中培养，设置光强为 ，光 暗 比 为 ，培 养 温 度 为，值调至，每天定时摇动锥形瓶次，当嗜热小球藻进入对数生长期后，以 转速离心 收集藻细胞。1.2试验条件设定试验中嗜热小球藻的初始吸光度 值为 ，在光强为 、光暗比为 、培养温度为 条件下，以 转速振荡培养。试验所用 溶液由（）母安全与环境工程 ：第 卷液配制，试验所用培养基、储备容器和锥形瓶均在高压灭菌锅中 处理 。嗜热小球藻生物量及 值的测定将 浓度设定为、，并将 溶液按浓度梯度稀释至改良的 （不加 ，排除 沉淀）培养基中，每个处理组设置个平行。取 藻液，于 波长处采用紫外可见分光光度计（，上海美普达仪器）测定其 值。同时，取 藻液，以 转速离心 ，取上清液通过 计（，广州铭睿）测定 值。1.4嗜热小球藻的半效应浓度测定首先，建立嗜热小球藻藻细胞密度与吸光度的线性关系：取 藻液，于 波长处采用紫外可见分光光度计测定其 值；利用血小板计数法得该 值下对应的藻细胞个数，将两者进行线性拟合，得出藻细胞密度与吸光度的线性关系。然后，根据上述生物量试验中第小时及第 小时藻细胞的 值，依照线性关系得出藻细胞密度，并根据下列公式计算出不同 浓度下藻细胞的抑制率：（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）式中：（）为处理组藻细胞的增长速度 个（）；（）为空白组藻细胞的增长速度 个（）；为试验时间（）；为时刻处理组藻细胞密度（个）；为时 刻 空 白 组 藻 细 胞 密 度（个）；为藻细胞初始密度（个）；为藻细胞抑制率（）。将不同 浓度下藻细胞的抑制率与 浓度进行线性拟合，得出嗜热小球藻的 半效应浓度（）。1.5嗜热小球藻光合色素含量的测定将 浓度设定为、，藻细胞中光合色素含量根据 所 述 方 法 测 定。取 藻 液，以 转速离心 ，倒掉上清液，收集藻细胞，加入 的乙醇，下水浴 ，放置于冰箱中下充分提取；提取后过 的水系滤膜，采用紫外分光光度计测定培养液分别在 、和 波长处的吸光度。1.6嗜热小球藻抗氧化酶含量的测定将 浓度设定为、，在第天时测定藻细胞中超氧化物歧化酶（）和脂质过氧化产物丙二醛（）的含量。取培养后的藻液，低温离心（，），加 入 磷 酸 盐 缓 冲 液（，），冰浴超声破碎，获得粗酶提取液，并利用 试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定其 活性，采用硫代巴比妥酸法测定 含量。1.7嗜热小球藻对镉的吸附效率及吸附量建立嗜热小球藻藻细胞干重与吸光度的线性关系：取 藻液，于 波长处采用紫外可见分光光度计测定其 值；同时，称得 水系滤膜初始质量为，将藻液用 水系滤膜过滤，并放入 烘箱中，取出后称得质量为，则为藻细胞干重，将两者进行线性拟合，得出嗜热小球藻藻细胞干重与吸光度的线性关系。将 浓度设定为、，分别在第天、天、天、天、天、天、天时取藻液，将藻液经 水系滤膜过滤后暂放至（，珠海格力）冷冻保存，并在测样前加入 酸化，采用火焰原子吸收分光光度计（，）测定滤液中 含量。根据以下公式分别计算嗜热小球藻对 的吸附效率（）和吸附量（）：（）（）式中：为初始时刻溶液中 的浓度（）；为经过一段时间后溶液中 的浓度（）。（）（）式中：为溶液的体积（）；为嗜热小球藻的干重（）。结果与分析 浓度对嗜热小球藻生长及体系 值的影响通过测定嗜热小球藻在不同生物量下的 值和藻细胞个数，将两者进行线性拟合，拟合结果显示值为 ，表明两者之间存在良好的线性关第期裴福文等：镉对嗜热小球藻的毒性效应及生物富集研究系，因此通过测定小球藻的 值即可得出较为准确的藻细胞个数，从而反映嗜热小球藻的生长情况。不同 浓度对嗜热小球藻生长的影响，见图。图不同 浓度对嗜热小球藻生长的影响 由图可知：在 处理组中，嗜热小球藻的生物量在第天时有轻微下降，浓度越大，其生物量下降幅度越大，说明小球藻的生长受到抑制；随着反应时间的增加，小球藻的生物量逐渐增加，但不同 处理组表现出不同的生长差异；当加入 时，小球藻生长受到明显的抑制，其抑制作用随着 浓度的增加而增大，在第天时 浓度分别为 、的处理组中，小球藻的生物量相较于对照组分别减少了 、，这是因为 的加入，会导致藻细胞内的氧化还原稳态失衡，破坏了藻的光合作用，致使藻细胞畸形，影响了微藻内细胞物质含量，从而破坏了藻的正常生长代谢 ；在 处理组中，小球藻的生物量在第天有轻微下降，这是由于小球藻进入新的生长环境时，仍处于适应期，并且受到 的胁迫，其生长受到一定的抑制，而对照组因无 的胁迫，小球藻适应速度较快，从而表现出正常的生长状况。不同 浓度对培养液中 值的影响，见图。由图可知：在对照组（不加 ）中，随着反应时间的增加，培养液中 值逐渐增加，第天时培养液中 值增至；但在 处理组中，培养图不同 浓度对培养液中 值的影响 液中 值在第天均有所降低；随着 浓度的增加，培养液中 值的上升幅度逐渐降低，在第天时 浓度分别为、的处理组培养液中 值分别为 、，与培养液中初始 值相比增长幅度较小甚至降低。小球藻在无 胁迫下培养液中的 值增加，其原因是小球藻在进行光合作用时会吸收大气中的 ，在溶于水的过程中发生水解反应产生，使得反应体系中的 值上升；但随着 毒性的增加，小球藻的生长受到显著的影响，进而抑制了体系 值的升高，同时受 毒性的影响，藻细胞死亡破裂，其呈酸性的藻源有机物释放到溶液中，造成体系 值的降低。在 处理组培养液中 值在第天时短暂下降主要是因为 在溶液中与结合形成少量的氢氧化镉沉淀，导致培养液中 值短暂降低，但 值短暂降低后，随着小球藻生物量逐渐增加，培养液中 值均有所上升，其上升幅度与藻的生长情况相对应。不同 浓度胁迫下嗜热小球藻的 半效应浓度（）利用公式（）、（）、（）对不同 浓度胁迫下所对应的嗜热小球藻抑制百分比进行了计算，得到在 浓度为、时，小 球 藻 的 抑 制 率 分 别 为 、。将 浓度与对应的小球藻抑制率进行线性拟合，其拟合结果见图。由图可知：浓度与对应的嗜热小球藻抑制率两者之间呈现良好的线性关系，值为 ，安全与环境工程 ：第 卷图不同 浓度胁迫下嗜热小球藻的半效应浓度（）（）且在 胁 迫 下，小 球 藻 的 为 。微藻耐镉性能的不同可能与藻的种类、试验过程中的培养条件如培养基、光照、振荡、温度等因素有关。前人的研究表明，在 浓度下，普通小球藻有着 以上的生长抑制率。在 培养基中通过对蛋白核小球藻的耐镉性能进行测定，结果发现在 浓度下蛋白核小球藻有着 的生长抑制率。而对其他藻类，如铜绿微囊藻，其 仅为 ，对镉的耐受能力较差。本试验中筛选得到的嗜热小球藻的 为 ，在高浓度 胁迫下仍有较好的生长，表明该嗜热小球藻具有良好的耐镉性能。浓度对嗜热小球藻光合色素的影响不同 浓度对嗜热小球藻中光合色素的影响，见图。由图（）和（）可知，通过对嗜热小球藻藻细胞中光合色素含量进行测定，结果表明：随着 浓度的增加，小球藻中叶绿素和叶绿素的含量均有小幅度的降低；在培养后，在 浓度为、时，小球藻中叶绿素 含 量 相 较 于 对 照 组 分 别 减 少 了 、，而小球藻中叶绿素含量相 较 于 对 照 组 分 别 减 少 了 、；对小球藻中叶绿素与叶绿素有着类似程度的影响，在适应初期的第天，小球藻中这两种光合色素的含量均有所下降，随着时间的推移，在后期可观察到较为明显的 的毒图不同 浓度对嗜热小球藻中光合色素的影响 性效应。已有研究表明，当微藻受到 胁迫时，其光合作用明显减弱，可能是 取代叶绿素中的，破坏藻细胞的叶绿体膜系统，阻碍微藻细胞的正 常 光 合 作 用，造 成 藻 细 胞 中 色 素 含 量 的 降第期裴福文等：镉对嗜热小球藻的毒性效应