骨髓间充质干细胞对氧化应激...伤心肌细胞凋亡、自噬的影响_王琛琛.pdf

论著基础研究基金项目：河南省医学科技攻关计划项目（）作者简介：王琛琛，硕士，主管技师，研究方向：干细胞修复。通信作者：亓民，博士，主任医师，研究方向：老年代谢和干细胞修复。骨髓间充质干细胞对氧化应激损伤心肌细胞凋亡、自噬的影响王琛琛，郭彩茹 牛宇杰 王 皓 续 畅 亓 民 首都医科大学附属北京世纪坛医院临床基因与细胞工程中心，北京市；河南省肿瘤免疫与再生医学国际联合实验室（郑州大学附属洛阳中心医院），河南省洛阳市；洛阳市心脑组织损伤与修复重点实验室，河南省洛阳市；首都医科大学附属北京世纪坛医院药物及医疗器械临床试验机构，北京市【摘要】目的 探讨骨髓间充质干细胞（）对氧化应激损伤心肌细胞凋亡、自噬的影响。方法（）以不同浓度（、和 ）处理大鼠心肌细胞 、和，采用 检测细胞活力，筛选 的最佳作用浓度及作用时间以构建氧化应激损伤心肌细胞模型。（）将大鼠心肌细胞 分为对照组、组、组。组和 组均采用 诱导 建立氧化应激损伤心肌细胞模型，在此基础上，组加入对数生长期大鼠 进行共培养。对照组正常培养而不给予干预。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况，分别采用实时荧光定量、检测各组细胞自噬相关基因、微管相关蛋白 轻链（）和蛋白表达水平。结果 与对照组相比，组细胞凋亡率升高（）；与 组相比，组细胞凋亡率降低（）。与对照组、组比较，组、和蛋白表达水平均升高（均 ）。结论 可以通过抑制心肌细胞凋亡及增强心肌细胞自噬水平，以减轻氧化应激对心肌细胞的损伤，从而发挥心肌保护作用。【关键词】氧化应激损伤；骨髓间充质干细胞；心肌细胞；自噬；凋亡【中图分类号】；【文献标识码】【文章编号】（）：，（，；，；，；，）【】（）（）（，），（），广西医学 年 月第 卷第 期 ，（，），（），（），（），【】，心肌梗死是冠状动脉粥样硬化斑块破裂和继发血栓形成导致冠状动脉供血减少或中断，进而引起严重的心肌缺血和心肌坏死。心肌梗死的病理过程不可逆转且预后极差，已成为影响人类健康的主要问题。急诊冠状动脉介入治疗和溶栓治疗等干预虽然可以在一定程度上减轻心肌损伤，但因无法修复坏死心肌而难以获得最佳治疗效果。随着再生医学领域的临床转化进程不断推进，干细胞的再生潜能为心肌再生提供了可能。骨髓间充质干细胞（，）具有多向分化潜能，有助于受损心肌细胞的修复或再生，阻止心脏重构和心力衰竭的发生，在此过程中 的旁分泌功能发挥重要作用。细胞自噬是细胞成分的自我降解，其通过细胞膜包裹衰老、受损或失去功能的蛋白质及细胞器，形成自噬溶酶体后降解包裹的内容物，为细胞代谢提供原料，进而促进细胞的存活。自噬对维持心肌细胞内稳态非常重要。对缺血再灌注修复的作用机制目前尚未明确，细胞自噬可能发挥了关键作用。据此，本研究拟通过将 与诱导的氧化应激损伤心肌细胞间接共培养，探讨 修复氧化应激损伤心肌细胞的机制，并分析细胞自噬在该过程中的作用，从而为心肌再灌注损伤的治疗提供新思路，为预防和逆转缺血再灌注损伤的发生、发展提供理论与数据支持。材料与方法 材料 实验细胞：大鼠 赛业（广州）生物科技有限公司，货号：；大鼠心肌细胞（上海富衡生物科技有限公司，货号：）。主要试剂：高效 组织 细胞裂解液（货号：）、试剂盒（货号：）、凋亡试剂盒（货号：）、二喹啉甲酸（，）蛋白浓度测定试剂盒（货号：）均购自北京索莱宝科技有限公司；购自 公司（货号：）；一步法除基因组 第 一 链 合 成 预 混 试 剂 盒（货 号：）、彩色荧光定量预混试剂增强版（货号：）均购自天根生化科技（北京）有限公司；总 提取试剂盒（货号：）、微管相关蛋白 轻链（，）兔多克隆抗体（货号：）、兔多克隆抗体（货号）、兔多克隆抗体（货号：）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔（货号：）均购自北京碧云天科技有限公司。主要仪器：微量核酸检测仪（公司，型号：）；酶标仪（公司，型号：）；流式细胞仪（，型号：）；实时荧光定量 仪（公司，型号：）；电泳仪（公司，型号：）；蛋白转印仪（公司，型号：）；凝胶成像仪（上海天能科技有限公司，型号：）。细胞培养基：大鼠 的培养使用 大鼠 完全培养基赛业（广州）生物科技有限公司，货号：；大鼠心肌细胞 的培养使 ，用含 胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，货号：）和 青霉素链霉素双抗的低糖（公司，货号：）。实验方法 细胞培养：取出大鼠心肌细胞 和大鼠，复苏后接种于相应培养基，置于 、培养箱中培养，每 换液 次，待细胞密度达到 时进行传代培养，选择第 代细胞进行实验。诱导氧化应激损伤心肌细胞模型的浓度筛选：将对数生长期的大鼠心肌细胞 按 个、孔接种在 孔板中，置于、的培养箱中过夜培养，次日使用 清洗，用含 胎牛血清的低血清培养基饥饿培养 后，更换为终浓度含 、的培养基，分别孵育 、后每孔加入 试剂，放入 、培养箱中孵育 。采用酶标仪检测各孔在 波长处的吸光度，细胞活力 给药组吸光度值 组吸光度值。实验分组及干预：取对数生长期的大鼠心肌细胞 按 个、孔接种在 孔板中，并将细胞分成 组、组、对照组，置于 、的培养箱中过夜培养。取出 组 和 组 的 孔 板，加 入 的 处理 以建立氧化应激损伤心肌细胞模型；使用 清洗细胞 次后加入低糖（孔），将两组的 孔板置于 小室，然后在两组的小室中加入低糖（孔），组的小室中同时加入对数生长期大鼠（个、孔）；将两组小室置于、恒温培养箱中，培养 。取出对照组的 孔板并置于 小室，在小室中加入低糖（孔），然后将小室置于 、恒温培养箱，培养 。流式细胞术检测细胞凋亡情况：取干预 后的各组细胞，用 胰酶溶液消化，收集至流式管中，以 离心，弃上清液。加入 预冷的 重悬，离心 ，弃上清液，依次加入 及 ，混匀后避光孵育 ，然后加入 结合缓冲液重悬。于 内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。每组设置 个复孔，实验重复 次。实时荧光定量 检测自噬相关基因的表达情况：取干预 后的各组细胞，用 胰酶溶液消化，离心 后收集细胞沉淀，用 冲洗 次，次，采用 总 提取试剂盒提取细胞总，使用微量核酸检测仪测定总 浓度，按照 一步法除基因组 第一链合成预混试剂盒说明书进行 合成，按照彩色荧光定量预混试剂增强版说明书进行实时荧光定量 实验。引物由深圳华大基因股份有限公司合成，引物序列见表。反应体系包括 ，正向引物（）、反向引物（）、模板 、，总共 。反应条件为 预变性 ；变性 ，退火 ，延伸，共 个循环。采用 法计算、的 相对表达水平。每组设置 个复孔，实验重复 次。表 引物序列信息引物名称引物序列扩增长度上游序列：下游序列：上游序列：下游序列：上游序列：下游序列：检测自噬相关蛋白的表达情况：取干预 后的各组细胞，用胰酶溶液消化，然后加入高效 组织 细胞裂解液裂解各组细胞，提取细胞总蛋白，利用 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取 蛋白，进行 （）分离蛋白，然后在、的条件下将目的蛋白转移至 膜；脱脂牛奶室温封闭 膜 。分别加入 兔多克隆抗体（稀释比为 ）、兔多克隆抗体（稀释比为 ）、兔多克隆抗体（稀释比为 ），孵育过夜；洗膜 次，次；加入 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 二抗（稀释比为 ），室温孵育 ，洗膜（同上）。以 为内参，显影成像后利用 软件对条带灰度值进行分析。每组设置 个复孔，实验重复 次。统计学分析 采用 软件进行统计学广西医学 年 月第 卷第 期分析。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 检验或 法。以 为差异有统计学意义。结 果 诱导氧化应激损伤心肌细胞模型的浓度和干预时间筛选结果不同浓度 干预不同时间后，大鼠心肌细胞 活力差异均有统计学意义（均 ）。其中，在 干预 时，细胞活力约为，较能体现药效差异，且多次造模结果稳定，见表。因此选取 处理 的方法构建氧化应激损伤心肌细胞模型。表 不同浓度 干预后大鼠心肌细胞 活力的比较（，）浓度干预 干预 干预 值 值 组大鼠心肌细胞 凋亡情况的比较干预 后，与对照组相比，组细胞凋亡率升高（）；与 组相比，组细胞凋亡率降低（）。见图 和表。图 组大鼠心肌细胞 的凋亡情况表 组大鼠心肌细胞 凋亡率的比较（，）组别凋亡率对照组 组 组 值 值 注：与对照组相比，；与 组相比，。组大鼠心肌细胞 自噬相关基因表达情况的比较干预 后，与对照组、组比较，组 和 表达水平均升高（均 ）。见表。表 组 和 相对表达水平的比较（）组别 对照组 组 组 值 值 注：与对照组相比，；与 组相比，。组大鼠心肌细胞 自噬相关蛋白表达情况的比较 干预 后，组 蛋白表达水平高于对照组，蛋白表达水平低于对照组（均 ）；与 对 照 组、组 比 较，组 蛋白和 蛋白表达水平均升高（）。见表 和图。表 组、蛋白相对表达水平的比较（）组别 蛋白 蛋白对照组 组 组 值 值 注：与对照组相比，；与 组相比，。蛋白相对表达水平以 比值表示。图 组 蛋白和 蛋白的表达水平 讨 论 研究表明，缺血再灌注产生的过量活性氧簇主要是来自线粒体转运链，这些活性氧簇可直接损伤生物分子（脂质、蛋白质和），也可通过促凋亡途径间接引起生物分子损伤，导致细胞死亡。动物实验及临床实验已证实，可修复缺血再灌注受损的心肌细胞，改善心脏功能。此外，旁分泌的趋化因子、抗炎因子、生长因子、外泌体等，通 ，过发挥抗炎、抗凋亡、促进新生血管再生等作用对梗死心肌进行修复，从而改善心脏功能。本研究采用 诱导大鼠心肌细胞 建立氧化应激损伤心肌细胞模型，探讨 修复氧化应激损伤心肌细胞的途径。结果显示，与对照组相比，组细胞凋亡率升高（）；与 组相比，组细胞凋亡率降低（）。由此可见，可通过抑制心肌细胞凋亡来减轻氧化应激对心肌细胞的损伤，这与既往研究结果相似。自噬是一种细胞内降解过程，在减小梗死面积、保护心肌细胞和维持左心室功能方面发挥重要作用。许多研究表明，缺氧性或缺血性损伤后自噬增强可以保护心肌细胞免受损伤，心肌细胞自噬水平的上调可以减轻缺血再灌注损伤。而在缺血后的再灌注期间，活性氧簇的过量产生可导致细胞自噬功能障碍。本研究结果显示，与对照组、组比较，组、和蛋白表达水平均升高（），表明 可通过提高心肌细胞的自噬水平来发挥心肌保护作用。综上所述，可以通过抑制心肌细胞凋亡及增强心肌细胞自噬水平，来减轻氧化应激对心肌细胞的损伤，从而发挥心肌保护作用。对心肌细胞自噬水平的促进作用虽未得到更多的研究证实，但其对心肌细胞的保护作用已有较多的相关报告。通过哪种途径调节心肌细胞的自噬与凋亡，以及具体的作用机制如何，还需要进一步的研究来证实。参 考 文 献 佚 名 心肌梗死第四次全球统一定义（）临床心电学杂志，（）：王玥，施慧琳，许丽，等 再生医学发展态势及发展建议 生命科学，（）：，：，（）：邓海燕，刘馨，缪着，等 干细胞治疗心脏病的研究进展 中华细胞与干细胞杂志（电子版），（）：曹润峰，葛俊文，方霞，等 间充质干细胞源性外泌体 在心脏缺血性损伤修复中的研究进展 中华细胞与干细胞杂志（电子版），（）：李勇 骨髓间充质干细胞分泌外泌体中 调节心肌自噬对心肌梗死的保护作用 石家庄：河北医科大学，：，（）：，：，：，：，（）：禹 丽，许兰莹，黄启星，等 硫氧还蛋白 基因修饰骨髓间充质干细胞对心肌梗死大鼠血管生成及心功能恢复的研究 临床和实验医学杂志，（）：刘金峰，凌 斌 骨髓间充质干细胞对心肌梗死治疗的研究进展 中国医学科学院学报，（）：龙禹哲 骨髓间充质干细胞源外泌体通过传递 抑制缺氧复氧状态 心肌细胞自噬和线粒体自噬 遵义：遵义医科大学，（），（）：苏 波，龙曼云，郑静，等 调控的自噬对缺血缺氧致 心肌细胞损伤的保护作用 广西医科大学学报，（）：，（）：，（），（）：，（）：广西医学 年 月第 卷第 期 ，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：（收稿日期：修回日期：）（上接第 页）综上所述，采用“耳一针”针刺联合聪耳息鸣汤加减治疗难治性突发性聋可明显改善患者听力，疗效显著，值得在临床推广应用。但目前针刺联合中药治疗难治性突发性聋还存在很多不足，例如，在综合医院中，大部分西医医生没有经过系统学习中医知识而难以做到对暴聋的辨证分型，且缺乏大样本及多中心