狗肝菜总黄酮微波辐射预处理提取工艺及其生物活性研究_孙金秋.pdf

收稿日期：2022-04-20；修回日期：2022-05-06基金项目：国家重点研发计划项目“民族医药发掘整理与学术传承研究”（2017YFC1703903）作者简介：孙金秋，女，河南周口人。*通信作者：陈旭波，男，浙江丽水人，高级实验师，硕士。狗肝菜总黄酮微波辐射预处理提取工艺及其生物活性研究孙金秋，陈旭波*（丽水学院 生态学院，浙江 丽水 323000）摘要：为了更深入研究狗肝菜总黄酮的提取工艺，为后续的研究奠定基础，本文采用微波辐射预处理结合传统水浴法对狗肝菜总黄酮进行提取，并以芦丁标准品作为对照品，采用紫外可见分光光度计测定吸光度并分析狗肝菜中总黄酮的含量。以单因素试验为基础，采用响应面优化工艺参数得到狗肝菜总黄酮的最佳提取率。结果显示：微波辐射预处理提取狗肝菜总黄酮的最佳工艺条件为微波功率 350 W、微波时间 77 s、汽化剂用量 4.3 mL，在此条件下狗肝菜总黄酮提取率为 8.382。在抗肺癌活性细胞试验中，狗肝菜总黄酮提取物的半抑制浓度为 9.516 mg/mL，在药物浓度 27 mg/mL 时，抑制率达到了 88.419%。研究结果表明：微波辐射预处理提取狗肝菜总黄酮是可行的，其总黄酮提取物（乙醇提取物）具有一定的抗肿瘤细胞活性，可以为今后的研究提供参考。关键词：狗肝菜；微波预处理；响应面优化；总黄酮提取；抗肿瘤细胞活性doi：10.3969/j.issn.2095-3801.2023.02.008中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：2095-3801（2023）02-0048-09A Study on Extraction Technology of Total Flavonoids from Diclipterachinensis by Microwave Radiation Pretreatment and Its BiologicalActivitySUNJinqiu,CHENXubo*（School ofEcology,Lishui University,Lishui 323000,Zhejiang）Abstract：To further study the extraction process of total flavonoids from Dicliptera chinensis(L.)Juss and lay thefoundation for the subsequent research,microwave irradiation pretreatment combined with traditional water bathmethod was used to extract total flavonoids from D.chinensis.The ultraviolet-visible spectrophotometry(UV)withrutin standard substance as reference substance was used to determine the total flavonoids in D.chinensis.Basedon the single factor experiment,response optimization method was used to optimize the extraction process of totalflavonoids.The final results showed that the optimal extraction conditions were as follows:microwave power 350丽 水 学 院 学 报JOURNAL OF LISHUI UNIVERSITY第 45 卷第 2 期Vol.45No.22023 年 3 月Mar.2023狗肝菜（Dicliptera chinensis(L.)Juss.），为爵床科（Acanthaceae）狗肝菜属植物，主要分布于福建、安徽、广西、台湾、广东等地，多生长在路边、村边、草丛及水沟边，具有凉血、生津、利尿、清热解毒等功效，可用于治疗肺热咳嗽、咳血、伤寒发热、急性结膜炎、流行性角膜炎、流行性乙型脑炎、急性肝炎、便血和痢疾等症1-5，属于药食同源的植物。中医临床和民间用药的实践表明其具有较为良好的医用价值。但是，目前国内外对其化学成分的研究很少6，其作用机理也需要进一步的研究。现代药理研究表明：狗肝菜的主要活性物质为黄酮和多糖。黄酮类化合物具有多种生理活性和药理作用，如抗肿瘤、抗氧化、抗过敏、抗菌消炎、抗心律失常、治疗急慢性前列腺炎、增强心血管功能、延缓体内的衰老、提高机体的免疫力、调理自身内分泌系统的紊乱、降血糖血脂、保肝护肝，所以在食品和医学等领域应用较为普遍7。研究指出：狗肝菜中的黄酮化合物清除 DPPH 自由基和羟基自由基的活性显著，清除效果随着狗肝菜黄酮质量浓度的增加而逐渐增强8。狗肝菜中含有较多临床应用的黄酮类成分，如芦丁、水飞蓟素、黄芩苷、葛根素等9，因此，狗肝菜总黄酮值得深入研究。黄酮类化合物的主要提取工艺包括热水浸提、碱液法提取、醇提取法、系统溶剂提取等传统的提取方法，以及二氧化碳超临界流体萃取法、大孔树脂法、酶法、超滤法、超声技术提取等现代提取方法。近年来，由于微波或超声波辅助提取结合响应面优化方法具有安全节能、保护活性成分、选择范围广、时间用量短、方法可靠等优势，已经被广泛运用到植物总黄酮的提取工艺优化中10-13。基于以上原因，本文将研究狗肝菜总黄酮微波辐射预处理提取工艺及其生物活性，并利用响应面法优化工艺条件，确定最佳工艺参数。1材料与方法1.1试验材料狗肝菜干粉：狗肝菜植株于 2020 年采自浙江省丽水市莲都区城东路与丽阳街交叉口的绿化带内，伴生植物为红叶石楠（Photinia fraseriDress），阴干，打粉，过 60 目筛，备用。1.2试验仪器与试剂电子天平（ISO9001，北京塞多利斯天平有限公司）；微波炉（G8023DH L-V8，佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司）；电热恒温水浴锅（HHS，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；SQ-UV 紫外可见分光光度计（WFZ UV-4802，上海尤尼柯仪器有限公司）；酶联免疫检测仪（BiotekSynergyH1，美国伯腾仪器有限公司）等。芦丁（HPLC 98%北京世纪奥科生物技术有限公司）、无水乙醇（杭州双林化工试剂有限公司）、NaNO2（浙江省兰溪市化工试剂厂）、Al（NO3）3（天津市大茂化学试剂厂）、NaOH（天津市大茂化学试剂厂）、MTT 试剂（sigma 公司）、DMSO（sigma公司）、磷酸盐缓冲液（赛默飞世尔生物化学制品有限公司）等。1.3芦丁标准曲线制备参考已有文献的研究方法14-16，准确称量 20 mgW,microwave time 77 s,dosage of vaporizer 4.3 mL.Under these conditions,the extraction rate of total flavonoidswas 8.382.In the anti-tumor activity cell test,the semi-inhibition concentration of total flavonoids extract was9.516 mg/mL,and the inhibition rate reached 88.419%when the drug concentration was 27 mg/mL.The resultsshowed that it is feasible to extract total flavonoids from Dicliptera chinensis by microwave radiation pretreatment,and its total flavonoids extract(ethanol extract)has certain antitumor activity,which could provide some basic datafor future research.Key words：Diclipterachinensis（L.）Juss.；microwaveradiationpretreatmen；responsesurfacemethod；flavonoids;antitumoractivity孙金秋，陈旭波：狗肝菜总黄酮微波辐射预处理提取工艺及其生物活性研究第 2 期49芦丁标准品，用 95%乙醇溶液溶解并定容于 100 mL容量瓶中，充分振摇混匀，得到 0.2 mg/mL标准品储备液。分别移取该溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于 25 mL 容量瓶中，用蒸馏水作为对照管零号管，分别加蒸馏水 6、5、4、3、2、1 mL，充分振摇混匀后静置 6 min，加入 1 mL质量分数为 5%的 NaNO2溶液，充分振摇混匀后静置 6min，然后加入 1mL质量分数为 10%的 Al（NO3）3溶液，充分振摇混匀后放置 6 min，再加入 10 mL质量分数为 4%的 NaOH 溶液，用蒸馏水定容至 25 mL，振摇混匀后静置 15min，以空白试剂为参比。用分光光度计在 510 nm波长处测定不同浓度下标准品的吸光值。以标准溶液浓度为横坐标 X，以吸光度为纵坐标 Y作图，得吸光度（A）与芦丁浓度（c）的标准回归方程。总黄酮提取率=总黄酮浓度稀释倍数提取液体积0.001510001.4单因素试验选择微波功率、微波时间、气化剂用量 3 个因素，试验设计如表 1 所示。表 1单因素试验因素水平微波功率/W210、280、350、420、490微波时间/s0、30、60、90、120气化剂用量/mL0、2.5、5、10、201.5响应面试验根据单因素试验结果，通过 Design-expert8.0.6 设计响应面，对微波功率（A）、微波时间（B）、气化剂用量（C）进行响应面设计，以狗肝菜总黄酮提取率为响应指标，对总黄酮提取工艺进行优化。1.6抗肿瘤细胞试验利用 MTT 法检测狗肝菜总黄酮提取物（乙醇提取物）抗肺癌细胞株（A549）增殖的能力17。取生长状况良好的细胞吸去旧培养液，用磷酸盐缓冲溶液（PBS 溶液）冲洗 23 次，用胰酶进行消化，最后用血细胞分类计数器计数。将细胞悬液接种于96 孔培养板中，每孔 100 L，放在温度 37、体积分数为 5的 CO2培养箱中培养 24 h，吸去旧培养液，将含药培养液以每孔 100 L加入 96 孔培养板中，将母药液不断稀释，最终制成质量浓度分别为 1、3、9、27、81 mg/mL的溶液，各质量浓度设置 3个平行，并设置 1 组空白对照组和 3 组试验对照组。置于恒温培养箱中培养，24 h 后观察，吸去旧培养液，每孔加入 120 L 含 MTT 液（1640 培养基和 MTT 试剂为 5：1）的完全培养基，继续放入 CO2培养箱中培养。4 h 后每孔加 150 L DMSO，确保各孔中的结晶物溶解完全。使用酶联免疫检测仪在波长 490 nm 处测量各孔吸光度值 A，根据公式计算得出细胞生长活性的半抑制率。各药物浓度组的生长抑制率（%）=（1加药组 OD值/对照组 OD值）100%。IC50=Log-1Xmi（P0.5）+i/4（1PmPn），式中：Xm为设计的最大浓度的对数值；i 为各浓度倍比浓度的对数值；P 为阳性反应率之和；Pm为最大阳性反应率；Pn为最小阳性反应率。1.7数据处理采用 Design-expert 8.0.6 软件进行多元回归拟合；利用 SPSS 16.0 进行方差分析；利用 Excel2010 作图。2结果与分析2.1芦丁标准曲线绘制由图 1 可知，芦丁标准曲线方程为 y=4.290 2x+0.003 9，R2=0.998 4，说明有较好的线