饲料中大肠菌群的测定 GBT 18869-2019.pdf

GB/T18869-2019杯，8000r/min10000r/min均质1min2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min,制成10倍稀释的样品匀液。注：含有硬物的原料，如肉骨粉等里面含骨渣易扎破均质袋，不宜用拍击式均质器，8.2.1.2液态样品：以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中，置于振荡器中振荡，充分混匀，制成10倍稀释的样品匀液。注：黏稠样品宜采用周态称量法，8.2.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取10倍稀释的祥品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管和吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换一只1L无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成100倍稀释的样品匀液。8.2.1.4根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换一只1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样液接种完毕，全过程不超过15mi。8.2.2乳精发酵试验每个样品选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管乳糖胆盐发酵管，每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料乳糖胆盐发酵管)，置36土1培养箱内，培养24h士2h,观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按8.2.3和8.2.4程序进行操作。8.2.3分离培养将产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上，置36士1培养箱内，培养18h24h,然后取出，观察菌落形态，并做确证试验，8.2.4确证试验在上述平板上，挑取可疑菌落1个2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36士1培养箱内，培养24h土2，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告大肠菌群为阳性。8.2.5试验程序图乳糖胆盐发酵法试验程序图见附录B。8.3IST发酵法8.3.1试样的稀释操作同8.2.1，8.3.2初发酵试验每个样品选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管LST肉汤，每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤)，36士1培养24h士2h,观察倒管内是否有气泡产生，24h士2h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48h士2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。8.3.3复发酵试验（证实试验）用接种环从产气的IST肉汤管中分别取培养物1环，移种于BGB管中，36士1培养48h士2h,