鸡的大小黄白卵泡的分离和总RNA提取生物技术专业.doc

鸡的大小黄白卵泡分离及总RNA的提取 目录 中文摘要： 2 关键词： 2 Abstract： 2 前言 2 1.材料和方法 4 1.1实验动物及其组织 4 1.2主要仪器和试剂 4 1.2.1实验仪器 4 1.2.2实验试剂 4 1.2.3溶液配制 5 1.3实验操作步骤 5 1.3.1取样 5 1.3.2大小黄白卵泡的提取 6 1.3.3总RNA的提取 6 1.3.4总RNA完整性鉴定 6 1.3.5 总RNA内基因组DNA的去除 6 1.3.6反转录反应 7 1.3.7 PCR反应 7 1.3.8 电泳检测 7 1.3.9 PCR产物纯化 7 1.3.10 连接转化 8 2.实验结论 8 2.1 鸡卵泡颗粒细胞 8 2.2 总RNA的检测结果 9 2.3 PCR检测 9 3.分析讨论 10 4.参考文献 12 中文摘要： 实验前,在大量查阅各项相关研究资料的前提下，明确了CART与蛋鸡卵巢中不同大小黄白卵泡中的雌激素（Estrodiol, E2）和孕酮（P）分泌量的关系。本实验运用显微外科手术技术分离蛋鸡的大小黄卵泡、大小白卵泡，并分别进行总RNA的提取，通过CART mRNA表达量的差异对CART蛋白进行定位，再通过体外注射dsRNA对CART的表达进行抑制，阻断CART对蛋鸡卵巢中卵泡生长发育及排卵的影响，从而提高蛋鸡产蛋量，延长产蛋周期，降低料蛋比，进而通过饲养试验，确定调控效果，并将该技术进行全面示范推广。 关键词：CART；卵泡；总RNA；dsRNA； Abstract： According to the information of related research before experiments, we found out the relationships between the amount of estrogen(E2) and progesterone(P), which the layer’s follicle in different size secreted ,and CART. During this experiment ,we used the microsurgical technique to isolate different follicles including Rhubarb follicle(LYF) , Small white follicle (SWF), yellow follicle (SYF) and the follicle (LWF).Otherwise, we have picked up the total RNA respectively and located the CART protein through the different amount of CART expression. Finally, we have suppressed the influences of CART on the follicles’ growth and ovulation in ovarian by means of injecting dsRNA artificially .As to improve the layers’ production, prolong period of laying and reduce the ratio of forage and eggs, we conducted the feeding experiments and determined the effect of the results, and then apply comprehensively to the actual producatons. Key words：CART(Classification And Regression Tree)；folliole；total RNA； 前言 我国蛋鸡已由上世纪80~90年代的数量蓬勃发展阶段，逐步进入微利时代，蛋鸡养殖的行业优势、价格优势也日趋降低，并开始按发展——竞争——平稳运行三个阶段经济模式运作。目前蛋鸡产业在精细化的管理、先进技术的应用及市场信息的支撑方面，逐渐发展成熟、完善。因此，要想提高蛋鸡养殖利润就要从根本上提高蛋鸡的产蛋量，降低料蛋比。 卵巢周期是产蛋过程的中心事件，只有成熟卵巢的卵泡才能释放卵子，然而，大于99%的卵巢卵泡在其发生过程中死亡而不能排卵。促卵泡素（FSH）启动原始卵泡发育后，又进一步促进部分卵泡形成腔，进入有腔卵泡的生长期。在对牛的卵泡发育研究中表明，当原始卵泡发育到了3~4mm有腔卵泡期，通常就会出现一次FSH水平的瞬时提高。有腔卵泡的继续生长依赖于FSH的支持，FSH刺激有腔卵泡的生长发育，同时又刺激颗粒细胞产生FSH受体（FSHR），随着FSHR数量的增加，卵泡颗粒细胞对FSHR反应也就越大，从而促使颗粒细胞不断发育。FSH短暂的增加，并刺激一群小的有腔卵泡开始发育，这是一个卵泡发育波的开始，其中只有一个优势卵泡继续发育到排卵的大小，这时FSH的浓度下降，并产生大量的雌激素（Estrodiol, E2），而其余的从属卵泡失去了产生E2的能力，并通过卵泡闭锁而死亡。近年来许多实验证明，在卵泡发育过程中，雌激素起着关键作用。E2不仅能提高卵泡对FSH的摄取，而且还可以通过提高FSH的浓度来刺激cAMP的积累能力，从而进一步提高卵巢卵泡颗粒细胞对FSH的反应性，还能增进FSH刺激其受体作用，能使颗粒细胞促黄体生成素受体明显增加，大大提高卵泡对两种促性腺激素的反应性，最终促使卵泡发育成熟并排卵。卵巢内卵泡E2产生能力的丧失导致卵泡闭锁。卵巢内雌激素产生是垂体促性腺激素和卵泡内调控分子的相互作用调控的，如类固醇激素和生长因子。 蛋鸡卵巢大约包含4000个原始卵泡，每个原始卵泡都有潜力形成一枚蛋黄，但只有不足1/4卵泡能够发育成熟和排卵，而蛋鸡企业中每只蛋鸡产蛋期内排卵约500~550枚，卵巢上大量参与发育的卵泡在其发生过程中闭锁和退化。卵泡发育过程中，垂体分泌的促性腺激素（E2和FSH）起着重要作用，促进卵母细胞的生长、卵泡细胞的增殖和卵泡腔的形成以及诱导卵泡排卵、黄体生成。近年来实验证明甾类激素，特别是E2对调控卵泡发育和黄体生成过程也起着重要的作用。蛋鸡卵巢E2对于卵泡的递次发育具有重要的调节作用，当卵巢上有最大卵泡存在的时候，其分泌的E2在垂体前叶抑制FSH和排卵诱导素（OIH）的分泌，对其它中小卵泡的发育起到抑制作用。但是，在高产家禽，其体内E2的含量也相对较高，因为这些家禽的卵巢上同时有数量较多的大中型卵泡存在，而E2主要是由大中型卵泡分泌的。而孕酮（P）能够刺激卵泡壁细胞的蛋白分解酶和胶原水解酶的合成，这两种酶分解卵泡壁细胞而引发排卵。同时，P对OIH的释放也有作用。大剂量的P由于能够抑制FSH和OIH的分泌，对卵泡发育和排卵会起到抑制作用。 CART是近年来在动物体内发现的一种内源性神经肽，参与人和动物多方面的生理功能。Spiess等 (1981) 在羊下丘脑的抽提物中分离出CART，Western Blotting 也证实了CART肽在脑、内脏、肾上腺、垂体等处均有分布。近年来美国密歇根大学研究人员在对牛的研究中首次证实CART对卵泡健康状况有负调节作用，并且CART对牛颗粒细胞产生的E2的基本含量也有负调控作用。同时，CART抑制牛颗粒细胞内由FSH诱导的cAMP水平、E2的积累和芳构化酶信使RNA水平的升高，从而引起颗粒细胞的凋亡并最终引起卵母细胞的闭锁。李鹏飞（2011）以猪、羊为研究对象，首次证明了CART在猪、羊卵巢中有表达，并对该基因全CDS区进行了克隆与表达载体的构建，目前已通过对猪、绵羊卵巢卵泡颗粒细胞体外培养，研究CART与E2产生的相互关系。 dsRNA是一种有互补链的RNA，与细胞中发现的DNA相似，dsRNA能够促发真核细胞中的RNA干扰，在细胞内诱导同源序列的基因表达受到抑制，引起脊椎动物中的干扰素反应。目前RNA干扰技术在科学界受到极大关注，主要是因为该项技术在干扰基因功能和相关方面的应用中具有许多传统方法无法比拟的特点和优势：（1）特异性 dsRNA干扰技术的最显著特征就是只引起与dsRNA同源的mRNA降解。实验表明，dsRNA能稳定表达的转基因和细胞内自身固有的内源基因表达，而对其它无关基因的表达不受影响；（2）高效性 无论是在体内还是体外实验中，仅需少量的dsRNA就能有效的抑制靶基因表达，其介导的RNA干扰是一个以催化放大的方式进行的；（3）dsRNA长度限制性 引发有效的RNA干扰的dsRNA最短不得短于21碱基，同时长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21nt左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割；（4）可传播性 dsRNA具有跨越细胞界限的能力，在局部注射dsRNA，能够传播到整个机体；（5）ATP依赖性 dsRNA干扰是一个ATP依赖的过程，整个过程由ATP提供能量。 目前虽然仍未找到CART的受体，但已经明确CART实现其生物学功能的途径就是与其受体结合，如果通过阻断CART与其受体结合或能够抑制CART的合成和表达，对于蛋鸡产业而言，无疑是一项重大技术发现。 1.材料和方法 1.1实验动物及其组织 本实验材料均来自晋中市太谷县屠宰场。选取十只健康蛋鸡组成实验群。待蛋鸡宰杀后，取下所有的十个卵巢，投入冰盒中制备好的杜氏磷酸缓冲液（DPBS）中，迅速带回实验室。 1.2主要仪器和试剂 1.2.1实验仪器 表一 实验仪器 仪器名称 型号 生产厂家 制冰机 SIM-F124 SANYO 超低温冰箱 UF-3410 Thermo 超净工作台 DL-CG-2ND 哈东联 电热恒温干燥箱 DEF-6210 上海一恒 高速冷冻离心机 Centrifuge 5810R Eppendorf 凝胶成像分析系统 GBS-7600B BIO-RAD PCR 扩增仪 PTC200 TaKaRa 电泳仪、电泳槽 DYY-Ⅲ-12B 六一 核酸蛋白检测系统 ND-100 Nanodrop 恒温振荡培养箱 LRH-250E 广东医疗器械厂 超纯水系统 NW10VF Healforce 将需要清除RNase枪头、离心管等放入固相RNase清除剂工作液浸泡5 min以上，烘干备用。 1.2.2实验试剂 表二.实验试剂 试剂 货号 出产公司 固相RNase清除剂 107105zyh Andybio Total RNA提取试剂 D9108A Takara 反转录试剂盒 DRR047A Takara 胶回收试剂盒 DV805A Takara 连接转化试剂盒 D102A Takara 感受态大肠杆菌DH5α D9057 Takara Taq DNA Polymerase ET101-01 北京天根生化科技有限公司 dNTP Mixture CD117 北京天根生化科技有限公司 1.2.3溶液配制 (1) DPBS溶液：500 mL 蒸馏水 + 4 g NaCl + 0.1 gKCl + 0.1 g KH2PO4 + 0.575 g Na2HPO4，溶解后高压灭菌备用。 (2) 50 × TAE Buffer：242 g Tris，37.2g EDTANa2，57.1 mL冰乙酸，NaOH溶液调pH至8.3，加去离子水定容至1 L后室温保存。使用时稀释50倍。 (3) 固相RNase清除剂：将蒸馏水与固相RNase清除剂按1000:1配制，室温下可保存24 h。 (4) EB储液 (10 mg/mL)