高效液相色谱结合Box-B...尾草根萜类成分提取纯化工艺_阿孜古丽·阿里木.pdf

基金项目国家地区自然科学基金项目（编号：）作者简介阿孜古丽阿里木，硕士研究生，从事天然药物活性成分研究 通信作者王新玲，博士，副教授，从事天然药物活性成分研究与开发高效液相色谱结合 响应面法优选新疆鼠尾草根萜类成分提取纯化工艺阿孜古丽阿里木，王启文，刘阳，马俊杰，王晓梅，胡君萍，王新玲（新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 ）摘要目的：优化新疆鼠尾草根萜类成分的提取纯化工艺。方法：建立能同时测定新疆鼠尾草根中，去氢罗列酮、齐墩果酸和熊果酸个萜类成分质量分数的 方法，以个成分的质量分数为指标，在单因素试验基础上，用 响应面法设计分析分别考察提取温度、提取时间和料液比个因素对萜类成分提取工艺的影响；考察萃取溶剂比例、萃取次数和振摇时间个因素对萜类成分纯化工艺的影响。结果：最佳提取工艺为加 倍 乙醇，回流提取次，每次 ，在此条件下测得个成分质量分数之和为 ；最佳纯化工艺为向提取物的水混悬液中加等比例的乙酸乙酯萃取次，每次振摇 ，在此条件下测得个成分质量分数之和为 ，是提取物的 倍。结论：响应面法优选新疆鼠尾草根中萜类成分的提取纯化工艺合理，可为制备新疆鼠尾草根萜类成分提供参考，也为进一步开发利用新疆鼠尾草提供科学依据。关键词新疆鼠尾草；响应面法；萜类成分；提取纯化工艺 中图分类号 文献标识码 文章编号 （）：，（，）：（），：，：；新疆鼠尾草（）为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，是我国鼠尾草属植物中的独特品种，主要分布于新疆天山山脉以北，常被称为新疆丹参。民间常以全草入药，具有清热解毒、消肿利尿、活血化瘀和抗菌消炎等功效。本课题组前期对其根进行了化学成分和相关药理活性研究，发现其化学成分主要为水溶性酚酸类和脂溶性萜类，与同科同属植物丹参（）具有相似之处，丹参的酚酸类成分可治疗糖尿病并发症；脂溶性成分可保护心血管系统。研究证明新疆鼠尾草根酚酸类成分可保护糖尿病肾病大鼠肾脏、防治糖尿病并发症；脂溶性萜类成分可显著抗血栓、抑制血小板聚集和凝血失活，故新疆鼠尾草根常作为丹参替代品用于临床。前期课题组对新疆鼠尾草根脂溶性二萜醌类成分的提取工艺进行了研究 ，所得提取物中以中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，去氢罗列酮为代表的总二萜醌类成分质量分数仅为 ，且已证明其可改善心肌缺血、抑制 和凝血酶诱导的血小板聚集和保护脐静脉内皮细胞的作用 。课题组研究还发现新疆鼠尾草根中含有以齐墩果酸和熊果酸为代表的三萜类成分，熊果酸可抗氧化、抗动脉粥样硬化 和保护心肌缺血损伤；齐墩果酸可保护心脏和抑制胶原、诱导的血小板聚集 。目前对新疆鼠尾草根萜类成分提取纯化工艺研究少有报道，故本文以，去氢罗列酮、齐墩果酸和熊果酸个代表性萜类成分质量分数为指标，应用响应面法优选该药材根中萜类成分的提取纯化工艺条件。因课题组研究显示该药材地上部分也含有酚酸类和萜类成分 ，为保护生态资源，本文用优选出的提取纯化工艺对新疆鼠尾草根和地上部分共 批样品进行了制备和质量控制，以期为合理开发新疆鼠尾草药材资源提供一定理论依据。材料 仪器 型液相色谱系统（日本岛津）；紫 外 检 测 器；柱 温 箱；型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；型分析天平（）。试药，去氢罗列酮（新疆医科大学药学院天然药物化学教研室提供，纯度）；齐墩果酸（中国 食 品 药 品 检 定 研 究 院，纯 度，批 号 ）；熊果酸（上海同田生物技术股份有限公司，纯度，批号 ）；甲醇（色谱纯）；超纯水。药材新疆鼠尾草（，批号 ）采自新疆乌鲁木齐市郊区艾维尔沟托里乡，经新疆医科大学药学院胡君萍教授鉴定为唇形科鼠尾草属新疆鼠尾草 的根。方法与结果 新疆鼠尾草中个萜类成分质量分数测定 色谱条件及系统适用性试验依利特 （，），流动相：甲醇 磷 酸（，），流 速：，检测波长：（测定，去氢罗列酮），（测定齐墩果酸和熊果酸）；柱温：；进样量。在上述色谱条件下，各相邻色谱峰间分离度均大于，拖尾因子在 ，理论塔板数以，去氢罗列酮峰计算均大于 ，满足质量分数测定要求，结果见图。混合对照品（）；供试品（）；，去 氢 罗 列 酮（，）；齐 墩 果 酸（）；熊果酸（）图新疆鼠尾草 混合对照品溶液精密称取对照品，去氢罗列酮、齐墩果酸和熊果酸适量置于同一 量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为 ，的混合对照品溶液。供试品溶液精密称定新疆鼠尾草根粉末（过 目筛），置于圆底烧瓶，加 乙醇 ，回流提取次，每次 ，过滤，合并滤液，干燥，甲醇溶解，微孔滤膜过滤，取续滤液即得。线性关系考察精密量取混合对照品溶液 ，分别置于 量瓶中，甲醇定容，微孔滤膜过滤，在上述色谱条件下分别进样，以个成分的色谱峰面积为纵坐标（），质量浓度为横坐标（），绘制标准曲线，回归方程分别为，去氢罗列酮.（.）；齐墩果酸.（.）；熊果酸.（.），个成分分别在 ，范围内线性关系良好。精密度试验精密吸取混合对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样测定次，结果个成分峰面积 分别为 ，表明仪器精密度良好。稳定性试验取同一供试品溶液分别于，进样 进行测定，结果个成分峰面积 分别为 ，表明供试品溶液在 内稳定性良好。重复性试验按“”项下方法制备份中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，结果个成分峰面积 分别为 ，表明该方法重复性较好。回收率试验精密称定已知含量的新疆鼠尾草根粉末份，分别按样品中个成分含有量的、加入混合对照 品 溶液适 量，按“”项下方法制备供试液并测定，结果，去氢罗列酮、齐墩果酸和熊果酸的平均回收率和 分别 为 和 、和 、和 （），表明该方法回收率良好。提取工艺的单因素试验考察 提取温度称取新疆鼠尾草根粉末（过 目筛）份，每份，加 倍量 乙醇，分别于，回流提取 ，过滤，干燥，甲醇溶解，在上述色谱条件下进样测定，结果个成分质 量 分 数 和 分 别 为 ，温度为 时质量分数和最高，故选取提取温度为。提取时间取新疆鼠尾草根粉末（过 目筛）份，每份，加 倍量 乙醇，分别回流提取，过滤，干燥，在上述色谱条件下进样测定，结果个成分质量分数和 分 别 为 ，提取 质量分数和最高，故选取提取时间为 。料液比取新疆鼠尾草根粉末（过 目筛）份，每份，分别加，倍 乙醇，回流提取 ，过滤，干燥，在上述色谱条件下进样测定，结果个成分质量分数和分别为 ，加入 倍 乙醇时质量分数和达最高，故选取料液比为 。乙醇体积分数称取新疆鼠尾草根粉末（过 目筛）份，每份，分别加 倍，乙醇，回流提取 ，过滤，干燥，在上述色谱条件下进样测定，结果个成分质量分数和分别为 ，显示随着乙醇体积分数的增大呈增加趋势，乙醇提取时质量分数之和达最高，结合 工 业 化 生 产 安 全 考 虑，选 提 取 溶 剂 为 乙醇。响应面法优选新疆鼠尾草萜类成分提取工艺 试验设计与结果由单因素试验结果，以个成分质量分数之和为考察指标，选取提取温度（因素）、提取时间（因素）和料液比（因素）个因素，用 软件中 响应面法设计试验，因素水平见表，试验设计与结果见表。表提取工艺因素与水平 水平因素（温度）（时间）（料液比）倍 表提取工艺试验设计与结果 实验序号（温度）（时间）（料液比）倍 质量分数和 方差分析以个成分质量分数之和为因变量，经 软件对各因素分别进行多元线性回归和二次拟合，得到回归拟合方程.（.，.），值越大，表明实际值与预测值之间具有相关性，拟合度良好；.，表明差异具有统计学意义，该模型能很好描述试验结果。拟合方程中各系数绝对值大小直接反映各因素对指标值的影响程度，可知个因素对个成分质量分数之和的影响大小为。结果见表。表显示拟合模型中（提取温度）因素对模型有显著影响，对个成分质量分数之和的影响较大，是影响提取的主因素。该模型 ，失拟项 ，表示失拟项没有显著性差异，模型实际值与预测值不拟合发生的概率低，实验误差相对较小，该模型显著拟合方程能较好预测试验结果。故可用该模型对药材萜类成分提取工艺进行分析和预测。因素、项对应的均低于.，说明其对响应值均有显著影响。中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，表提取工艺方差分析 变异来源平方和自由度均方模型 残差 失拟项 纯误差 总和 响应面与等高线分析根据所拟合的回归方程分别绘制各因素交互作用的三维响应面图和等高线图，可直观反映出各因素间的交互作用及对药材萜类成分质量分数和的影响，结果见图。最佳提取工艺预测采用 软件进行数据分析，得到最佳提取工艺参数为加 倍 乙醇，回流提取 ，在此理论优化条件下，个成分质量分数之和理论预测值为 。结合生产实际，将最优提取工艺调整为加 倍 乙醇，回流提取次，每次 。提取工艺验证试验取同一批新疆鼠尾草根粉末（过 目筛）份，每份 ，按优化出的提取工艺进行验证试验，在上述色谱条件下进样测定，结果个成分质量分数和为 ，为 ，与理论预测值的误差较小，说明优化的提取工艺稳定、可控。纯化工艺单因素试验考察 萃取溶剂比例精密称取“”项下制备的浸膏份，每份 置具塞锥形瓶，加 纯水，超声溶解，分别按 ，加入预实验所选的水饱和乙酸乙酯，密封后放入空气恒温振荡器中，振摇 ，萃取次，合并乙酸乙酯液，干燥。在上述色谱条件下进样测定，结果个成分质量分数和分别为 ，当萃取溶剂比为 时达最高，故选取 为最佳萃取溶剂比。萃取次数精密称取“”项下制备的浸膏份，每份 ，置于具塞锥形瓶，加 纯水，超声溶解，分别加 水饱和的乙酸乙酯，密封后放入空气恒温振荡器中，振摇 ，分别萃取，次，合并乙酸乙酯液，干燥。在上述色谱条件下进样测定，结果个成分质量分数之和分别为 ，当萃取次时达最高，故选取最优萃取次数为次。振摇时间精密称取“”项下制备的浸膏份，每份 置具塞锥形瓶，加 纯水，超声溶解，分别加 水饱和的乙酸乙酯，密封后放入空气恒温振荡器中，分别振摇，萃取次，合并乙酸乙酯液，干燥。在上述色谱条件下进样测定，结果个成分质量分数之和分 别 为 ，当振摇 时达最高，故选取 为最佳振摇时间。响应面法优选新疆鼠尾草萜类成分纯化工艺 试验设计与结果由单因素试验结果，个成分质量分数和为考察指标，选取萃取溶剂比例（）、萃取次数（）和振摇时间（）个因素，用 软件中的 响应面中心组合设计试验，因素水平见表，试验设计与结果见表。表纯化工艺因素与水平表 水平因素（溶剂比例）倍（萃取次数）次（振摇时间）方差分析通过 响应面分析软件对表数据进行回归拟合分析，得到质量分数与各因素水平间的二次多项式方程 .中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，图提取工艺的等高线图和三维曲面图 注（）：左图均为等高线图（），右图均为三维曲面图（）表纯化工艺试验设计与结果 实验序号（溶剂比例）倍（萃取次数）次（振摇时间）质量分数和 .。模型.，表示差异极显著，失拟项.，表示差异不显著，说明实验设计拟合度良好，误差小；.，说明实验可靠性较好，模型可用于分析和预测个因素对个成分质量分数的影响。结果见表。由表可知各因素对个成分质量分数的影响顺序为：萃取溶剂比例振摇时间萃取次数。为更直观反映各因素与响应值的关系，绘制各因素交互作用的三维响应面图和等高线图，见图。最佳纯化工艺预测采用 软件进行纯化工艺设计所得数据分析，得到最佳纯化工艺参数为萃取溶剂比例 ，萃取次数 ，振摇时间 ，在此理论优化条件下，理论预测个成分质量分数和为 。结合生中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，表纯化工艺方差分析 变异来源平方和自由度均方模型 残差 失拟项 纯误差 总和 图纯化工艺的等高线图和三维曲面图 注（）：左图均为等高线图（），右图均为三维曲面图（）。中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，产可操作性，将最优纯化工艺调整为萃取溶剂比例 ，萃取次，振摇 。纯化工艺验证试验精密称取“”项下制备的浸膏份，每份 置于具塞锥形瓶，加 纯水，超声溶解，分别加 水饱和的乙酸乙 酯，密 封 后 放 入 空 气 恒 温 振 荡 器 中，振 摇 ，萃取次，合并乙酸乙酯液，干燥。在上述色谱条件下进样测定，结果个成分质量分数和依次为 ，平均质量分数和为 ，为，比提取物提高了 倍。说明优化的纯化工艺合理、可行。不同批次样品质量分数测定用筛选的提取纯化工艺对 年 月份分别采集于新疆乌鲁木齐市郊区的药材地上和根共