高山杜鹃褐斑病病原学研究_寸海春.pdf

Research paper 研究论文 22 March 2023,42(3):707-718 菌物学报 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q Doi:10.13346/j.mycosystema.220087 资助项目：云南省自然科学基金(2017FB051)；科技部国际合作项目(2009DFA32360)This work was supported by the Natural Science Foundation of Yunnan Province(2017FB051)and the International Cooperation Program of the Ministry of Science and Technology,China(2009DFA32360).*Corresponding author.E-mail: Received:2022-03-14;Accepted:2022-10-08 Copyright 2023 Institute of Microbiology,CAS.All rights reserved.| Http:/journals- Tel:+86-10-64807521 菌物学报 707 高山杜鹃褐斑病病原学研究 寸海春1，何鹏搏1，何鹏飞1，吴毅歆1，Shahzad Munir1，汤再祥2，何月秋1*1 云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201 2 云南海达新花景园艺种苗有限公司，云南 昆明 605233 摘 要：为明确引起高山杜鹃褐斑病的病原菌及其生物学特性，采用形态学及分子生物学方法对病原菌进行了鉴定，并采用平板培养法研究了该病菌的生物学特性，筛选了化学杀菌剂及生防细菌。形态特征及 rDNA-ITS 序列、-tubulin 基因和 tef1 基因序列分析结果表明，引起高山杜鹃褐斑病的病原菌为棒孢新拟盘多毛孢 Neopestalotiopsis clavispora；该病原菌最适生长温度为 2528，适宜在偏酸性培养基上生长，最适碳、氮源分别为葡萄糖和牛肉膏，最适生长培养基为 PDA。毒力测定结果表明，苯醚甲环唑、氟硅唑、氟环唑、戊唑醇及异菌脲对棒孢新拟盘多毛孢的 EC50分别为0.799 1、2.275 6、2.742 5、3.736 6 和 4.875 7 mg/L；实验室前期筛选出芽胞杆菌属的 4 株生防细菌，在室内处理离体叶 10 d 后，对褐斑病的防效达 57.51%75.97%。为研究高山杜鹃褐斑病的防控提供了科学依据。关键词：高山杜鹃；褐斑病；棒孢新拟盘多毛孢；杀菌剂；生防菌 引用本文 寸海春，何鹏搏，何鹏飞，吴毅歆，Shahzad Munir，汤再祥，何月秋，2023.高山杜鹃褐斑病病原学研究.菌物学报，42(3):707-718 Cun HC,He PB,He PF,Wu YX,Shahzad Munir,Tang ZX,He YQ,2023.Etiology of the pathogen causing brown leaf spot on Rhododendron lapponicum.Mycosystema,42(3):707-718 Etiology of the pathogen causing brown leaf spot on Rhododendron lapponicum CUN Haichun1,HE Pengbo1,HE Pengfei1,WU Yixin1,Shahzad Munir1,TANG Zaixiang2,HE Yueqiu1*1 College of Plant Protection,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,Yunnan,China 2 Yunnan Haida New Flower Landscape Horticultural Seed and Seedling Co.,Ltd.,Kunming 605233,Yunnan,China Abstract:The pathogen causing brown leaf spot of Rhododendron lapponicum was identified by 寸海春 等/高山杜鹃褐斑病病原学研究 研究论文 菌物学报 708 morphological and molecular methods,and the biological characteristics of the pathogen were studied based on observation of plate cultures,and the fungicides and biocontrol agents were screened.The pathogen was identified as Neopestalotiopsis clavispora based on its morphological characteristics and rDNA-ITS,-tubulin and tef1gene sequences.The mycelium grew at 2528 C suitably and preferably in acidic medium.Glucose and beef paste were the best carbon and nitrogen sources for its mycelial growth,respectively.PDA was the best culture medium among 8 media tested.Toxicity bioassay showed that difenoconazole,flusilazole,epoxiconazole,tebuconazole and iprodione were the effective chemical fungicides with EC50 of 0.799 1,2.275 6,2.742 5,3.736 6 and 4.875 7 mg/L,respectively.Four Bacillus isolates could antagonize the growth of mycelium and their control efficacy of the disease on detached leaves was 57.51%75.97%.The results provided a scientific basis for the prevention and control of brown leaf spot of R.lapponicum.Keywords:Rhododendron;brown leaf spot;Neopestalotiopsis clavispora;fungicide;biocontrol agent 高山杜鹃隶属于杜鹃花科 Ericaceae、杜鹃花属 Rhododendron L.，是中国十大名花之一，花大色艳、叶色光亮常绿，具有较高的观赏和园林应用价值，主要分布在云南、四川、贵州和西藏等西南地区，目前云南地区高山杜鹃的总量已超过 1 000 万株，占全国总量的 80%以上(杨秀梅等 2019)。随着种植面积逐年扩大，其病害发生也越来越严重。根部或枝干病害主要有茎腐病、溃疡病、根腐病和枯梢病等，叶部病害主要有炭疽病、灰霉病、褐斑病、黑斑病和枯叶病等(任纬恒 2019)。引 起 杜 鹃 炭 疽 病 的 病 原 菌 主 要 为Colletotrichum，黑斑病主要由 Alternaria 引起，Phomopsis 可引起杜鹃褐斑病(潘欣等 2008)，枯叶病主要由 Phytophthora 引起，Pestalotiopsis 也可引起杜鹃花花瓣发病(Rivera&Wright 2000)，这些病害在潮湿多雨的季节容易发生，严重制约高山杜鹃的观赏及园林应用价值，但目前高山杜鹃病害的发生与防控方面的研究相对有限。2020 年 12 月，笔者在高山杜鹃品种“锦缎”上发现了一种极其严重的叶部真菌病害(褐斑病)，最初出现褪绿小斑点，边缘黄绿色，病健交界不清，渐变为浅褐色至不规则褐色病斑，边缘深褐色，老病斑正面覆盖灰白色的霉状物，并可见到黑褐色的小颗粒，叶片背面病斑浅褐色，严重影响该品种经济价值和观赏价值，杀菌剂嘧菌酯对其防效差。为了有效控制该病害，本研究对其开展了病原学研究，并筛选了对该病害有效的化学杀菌剂和生防菌剂，以期对高山杜鹃褐斑病的发生和防控提供理论依据。1 材料与方法材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病样 采集具有典型褐斑症状的高山杜鹃“锦缎”叶片，保鲜带回实验室进行病原分离。1.1.2 培养基及试剂 培养基：PSA、PDA、燕麦培养基、胡萝卜培养基、Czapek 培养基参照方中达(1998)的方法配制。高山杜鹃汁液琼脂培养基(200 g/L 杜鹃叶片，20 g/L 琼脂)，高山杜鹃汁液+PSA 培养基(200 g/L 杜鹃叶片+PSA)等。引物：ITS 基因片段引物 ITS1(5-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3)和 ITS4(5-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3)、-tubulin 基因片段引物Bt2a(5-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3)和 Bt2b(5-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGG C-3)、tef1 基因片段引物 EF1-526F(5-GTCGTY Research paper 22 March 2023,42(3):707-718 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q 菌物学报 709 GTYATYGGHCAYGT-3)和 EF1-1567R(5-ACH GTRCCRATACCACCRATCTT-3)。试剂：PCR 扩增反应所需的 Buffer、Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA、Marker 等均来自生工生物工程(上海)股份有限公司。1.1.3 生防菌株 Bacillus velezensis 3-3 及 5-10、B.subtilis 4-5、B.amyloliquefaciens 5-3 等 4 个生防芽胞杆菌为实验室保藏菌株，均为八角 Illicium verum 叶片内生菌。1.1.4 化学杀菌剂 8 种化学杀菌剂原药分别为：95%氟硅唑(海南利蒙特生物农药有限公司)，98%异菌脲(江西施普润农化有限公司)，98%吡唑醚菌酯、95%氟环唑(浙江禾本科技股份有限公司)，95%苯醚甲环唑、96%嘧菌酯(浙江威尔达化工有限公司)，97%戊唑醇、98%福美双(河北益海安格诺公司)。1.2 方法 1.2.1 病原菌分离纯化 采用组织分离法分离病原菌，用 75%乙醇浸泡病叶组织 2 min，切取病健交界处 1 mm1 mm大小的组织块，置于 PSA 平板中央，25 黑暗恒温培养 3 d 后，挑取菌落边缘的菌丝块转接培养、纯化，并保存备用。1.2.2 致病性测定 依据柯赫氏法则，将褐斑病病原菌在 PSA平板上培养 67 d 后，取直径为 5 mm 的菌饼接种到健康高山杜鹃“锦缎”叶片上，置于带有无菌吸水纸的培养皿中，以不含病原菌的 PSA 培养基圆饼作为空白对照，每个处理 3 次重复。接种后的叶片放于 25 的光照培养箱中保湿培养(光照 14 h，黑暗 10 h)，每天观察叶片发病情况。发病后对病组织重新进行病原菌分离，与接种菌株培养特征比较，确认病原菌的致病性(李博勋等 2014)。按照上述方法，确定病原菌在垂丝海棠及石榴叶片上的致病性。1.2.3 病原菌鉴定 形态学鉴定：将病原菌接种至 PSA 平板上，25 恒温黑暗培养 7 d，观察菌落形态、颜色等。用显微镜观测分生孢子的形态特征、颜