水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法 GBT 22916-2008.pdf

GB/T22916-2008水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。本标准适用于动物及其产品中水泡性口炎病毒的检测。2缩略语下列缩胎语适用于本标准。2.1荧光RT-PCR荧光反转录-聚合酶链反应。2.2Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数。2.3 RNA核糖核酸。2.4 DEPC焦碳酸磷酯。2.5 PBS磷酸盐缓冲盐水（配方见附录A)。2.6Tag酶Tag DNA聚合酶。2.7 VSV水泡性口炎病毒。3原理水泡性口炎病毒属RNA病毒，根据水泡性口炎病毒两型共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。通过严格设计和筛选的引物和探针，涵盖水泡性口炎病毒的两个型和突变株，为水泡性口炎病毒的特异性通用引物和探针。探针的5端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团；3端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。在扩增时，Tq酶发挥它的53端外切核酸酶的功能，将探针水解成单核苷酸，消除阻碍，标记在探针两端的报告荧光基团和淬灭荧光基团均游离于溶液中，仪器检测到发出的荧光信号。4材料与试剂4.1仪器与器材4.1.1荧光RT-PCR检测仪，4.1.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上），4.1.3台式离心机（离心速度3000r/min)。4.1.4混匀器。4.1.5冰箱(2C8和-20C两种)。4.1.6微量可调移液器(5L,10L,100L,1000L)及配套带滤芯吸头。