流行性乙型脑炎诊断技术 GBT 18638-2002.pdf

GB/T18638-20020.01mL0.02L)。然后用左手拇指及食指抓住小鼠头顶部皮肤，翻转左手，使小鼠腹部朝上，将其尾部夹在左手掌与小手指之间，消毒腹部，右手持注射器向腹腔内注入样品0.2mL0,5mL。2.2.3.2对照小鼠2只，按同法同剂量注射稀释液。2.2.3.3接种后2d4d,如对照鼠正常，而注射样品的小鼠表现松毛、弓背、沉郁、震颜、绕因、后肢麻痹、继而死亡者，应解剖取鼠脑组织，按2.2.2.3制成接种样品，按2.2.3.1再接种小鼠。连续2代接种小鼠均有发病致死者，而且未检出致病细菌时，一方面继续传代并作鉴定，另一方面用冰冻干燥法保存毒种。2.2.34接种小鼠经7d14d无一发病时，则取出2只，解剖取脑组织，按2.2.2.3制成样品盲传一代，观察2周如仍无死亡，即按未分离出病毒报告。2.2.4组织培养法2.2.4.1取2.2,2制成的样品，接种鸡胚细胞、仓鼠肾单层细胞或Vro、BHK1,C6/36传代细胞单层，每份样品至少接种10管（或瓶），每管0.1mL0.2mL,37C吸附1h,用Hanks液洗1次，加入EMEM液1mL,放37C培养7d10d。2.2.4.2同时设细胞对照2管（或瓶），不接种样品，其他步骤与接种样品管相同。2.2.4.3接种后观察约10d,第二天开始，每天在显微镜下观察细胞病变，若细胞对照管正常，而接种样品管细胞出现细胞萎缩、脱落、形成空斑等病变时，立即移种新的细胞单层，如出现相类似的病变，且日渐明显，即可收获，放一25C一30C冰箱保存待检。2.2.4.4如盲传3代均无细胞病变，即按未分离出病毒报告。2.2.5鸡胚培养法2.2.5.1取2.2.2制成的样品，接种于6d8d龄鸡胚卵黄囊内，每胚接种0.5mL,每份样品至少接种4胚。2.2.5.2同时设对照鸡胚2个，对照鸡胚接种稀释液0.5mL。2.2.5.3置37C培养4d,48h后对照鸡胚正常，而接种样品鸡胚死亡或到期未死亡者，解剖取出鸡胚磨碎，用减性肉汤制成10%悬液，3000r/min离心30min,取上清液按2.2.3接种小鼠。2.2.5.4如小鼠发现2.2.3.3中死亡时，解剖取脑组织，冰冻保存待检。2.2.5.5如鸡胚培养3代均正常，即按未分离出病毒报告。2.2.6病毒的鉴定经小鼠、鸡胚或组织培养法分离获得能稳定传代的病原，在细菌培养基上不生长，经除菌过滤(G5级玻璃滤器或0.45m微孔滤膜)仍保留其繁殖力和致病力，即可以认为已分离到病毒。2.2.6.1初步鉴定：将待检病毒制备抗原，用血凝抑制试验（第4章）、补体结合试验（第5章）作初步鉴定，确定病毒的属性。三种方法任选一种。2.2.6.2最后鉴定：小鼠中和试验方法如下：a)首先将被检血清56C30min灭活：b)与10倍连续稀释的乙型脑炎病毒等量混合，在37C感作1；)给3周龄小鼠脑内接种，每只接种0.03mL,每一稀释度病毒脑内接种相同小鼠5只，观察2周；d)根据各稀释度小鼠的死亡数和存活数按半数致死量(Rced一Muench)法计算LDo:)操作中要设病毒对照组（已知参考病毒加阴性血清），阳性血清对照组（已知参考病毒加阳性血清)：)试验组为（被检病毒加阳性血清）：g)结果判定：组LDs。一组LDso=阳性血清中和已知参考病毒的中和指数：组LDs。一组LDs=阳性血清中和被检病毒的中和指数。两者中和指数相接近（相差0.5LD和），即可确定分离的病毒为流行性乙型脑炎病毒。如对中和指