奶牛脊椎畸形综合征检测 PCR-RFLP法 GBT 25887-2010.pdf

GB/T25887-20106试剂和仪器6.1主要试剂水应符合GB/T6682的灭菌双蒸水。Tag DNA聚合酶及PCR缓冲液、RsaI限制内切酶及10X酶切缓冲液、蛋白酶K、DNA分子质量标记购自试剂公司。TE缓冲液、TAE缓冲液、TBE缓冲液、PBS缓冲液，加样缓冲液、10%过硫酸铵、30%丙烯酰胺、10%聚丙烯酰胺、溴化乙锭、10%SDS、1mol/LTis-HC1、0.5mol/L EDTA(pH8.0)、三氯甲烷/异戊醇(24：1)、3mo/L乙酸钠、固定液，脱色液、染色液、显影液、停显液等。具体配制方法参见附录A。6.2主要仪器冷冻离心机、核俊蛋白浓度测定仪、梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、H计、电子天平、恒温水浴锅、双蒸榴水器、微量移液器。7检测步骤7.1牛基因组DNA制备采用常规的酚仿抽提法提取牛样本基因组DNA。4冰箱中保存备用。7.2PCR扩增及其产物检测20LPCR反应体系：0.4mol/L引物，0.2mmol/L dNTP,待测DNA85ng100ng、1UTaqDNA聚合酶、10XPCR缓冲液，加适量双蒸水。可根据需要调整反应体系。PCR反应条件：94变性3min,35个循环(9430s,6530s,7230s),72延伸10min,4保温2min10min。取2 L PCR产物，2%3%琼脂糖凝胶电泳(3V/cm5V/cm,电泳20min30min),溴化乙锭(EB)染色后，在凝胶成像系统观察条带。PCR扩增结果示意图见附录B中的图B,1。7.3酶切及其产物检测取16LPCR增产物，加入5U限制内切薄RsaI和2L10X酶切缓冲液，加水至20L,反应条件参见产品说明书。10%12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(3V/cm5V/cm,电泳3h4h),银染（染色方法参见附录C)。酶切图谱见附录B中的图B.2。7.4结果判定由于24bp的条带太小，以致在10%12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时显示不出来，但可根据225bp、201bp条带进行样本基因型判定。健康奶牛：基因型为GG型，即出现201bp一条电泳带；隐性携带者：基因型为GT型，即出现225bp、201bp两条电泳带；CVM患者：基因型为TT型，即出现225bp一条电泳带。GB/T25887-2010附录A(资料性附录)主要试剂及配制方法表A.1主要试剂及配制方法试剂配制方法TE缓冲液10 mmol/L Tris-HCK(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0)242 g Tris做，57mL冰乙酸，100mL0.5mol/L EDTA(pH8.0),加双蒸水定容至50XTAE缓冲液1000mL,使用时50倍稀释10%过硫酸铵称取1g过硫酸铵溶于8mL双蒸水，定容至10mL54.0 g Tris碱，27.5g酸，20mL0.5mmo/L EDTA(pH8.0),加双蒸水定容至5TBE缓冲液1000mL,使用时5倍稀释30%丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲丈300mL双蒸水中溶解145g丙烯能胶，5g甲叉双丙娇酰胶，用双蒸水定容至双丙烯酰胶=29：1)500mL量取9.3mL30%丙娇酰胶，18.5mL双蒸水，7mL5TBE,0.23mL10%过硫酸10%聚丙烯酰胶胺战.0.02 mL TEMED加样毁冲液0.25%溴酚蓝（质量浓度），40%滋糖（质量浓度）100mL双蒸水中加人0.1gEB(10mg/mL),搅拌使完全溶解，转入棕色试剂瓶，溴化乙锭(EB)锡箔包裹PBS缓冲液氯化钠8g,辞酸氢二钠1.44g,氯化钾0.2g,磷酸二氢钾0.24g加双蒸水定容至1000mL,调pH值至7.0，高压灭菌，室温保存10%SDS称取50gSDS加热蒂于400mL双蒸水中，定容至500mL,高压灭菌，室温保存称取121.4gTis碱溶于800m双蒸水中，加浓盐酸调至pH8.0,定容到1000mL,1 mol/L Tris-HCI高压灭菌，室温保存称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠溶于800mL双蒸水中，加人氢氧化钠（约0.5 mol/L EDTA(pH8.0)20g)调至pH8.0,定容到1000mL,高压灭菌，室温保存三氧甲烷/异戊醇(24：1)量取480mL三氯甲烷，加人20mL异戊醇，混匀称取408.1g三水乙酸钠溶于800mL双蒸水中，用乙酸调至pH5.2,加水定容至3mol/L乙酸钠1000mL,高压灭菌，室温保存固定液450mL双蒸水中加人50mL乙醇脱色液492.5mL双蒸水中加人7.5mL浓硝酸染色液500mL双蒸水中溶解1g硝酸银，置棕色瓶中保存500mL双蒸水中溶解15g无水碳酸钠，加入1.32mL甲醛(0.046%)，用双蒸水定显影液容至1000mL停显液485mL双蒸水中加人15mL冰乙酸