干扰ACACA基因对猪原代...增殖和成脂转分化过程的影响_雷宇航.pdf

第 41 卷 第 2 期2023 年 4 月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.41 No.2Apr.2023干扰ACACA基因对猪原代肌卫星细胞增殖和成脂转分化过程的影响雷宇航1，2#，谭娅1，2，3#，黄志洋1，2，赵梦颖1，2，齐婧3，甘麦邻1，2，沈林園1，2*，朱砺1，2*（1.四川农业大学畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室，成都 611130；2.四川农业大学动物科技学院/农业农村部畜禽生物组学重点实验室，成都 611130；3.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵阳 550005）摘要：【目的】探究乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACACA）对猪原代肌肉卫星细胞（muscle satellite cells，MSCs）增殖凋亡以及成脂转分化的影响。【方法】通过体外培养MSCs模拟猪肌内脂肪的形成过程，根据ACACA基因序列构建3条小干扰RNA，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）筛选出干扰效率最高的siRNA进行转染。成功干扰MSCs内ACACA的表达后，分别通过qRT-PCR、CCK-8细胞增殖实验、流式细胞术、油红O染色和检测甘油三酯（TG）等方法对MSCs增殖、凋亡以及转分化时期脂滴形成效果进行评估。【结果】在增殖期干扰ACACA，MSCs内细胞周期标志基因Cyclin D1（P0.05）、Cyclin E（P0.000 1）以及抗凋亡基因BCL-2（P0.05）的表达量下调，促凋亡基因BAX（P0.05）的表达量上调；在对MSCs进行成脂转分化诱导作用下，MSCs具有向脂肪细胞转分化的能力，而干扰ACACA后，MSCs中脂滴极显著减少（P0.000 1）。【结论】干扰ACACA后抑制猪MSCs的增殖，促进其凋亡，并且对成脂转分化时期脂滴的形成具有抑制作用。研究结果为后续研究ACACA对肌内脂肪的影响及猪肉制品调控机制研究提供实验参考和基础数据。关键词：乙酰辅酶A羧化酶；猪骨骼肌；原代肌卫星细胞；siRNA；转分化中图分类号：S828；Q75 文献标志码：A 文章编号：1000-2650（2023）02-0335-09Effects of ACACA Gene Interference on Proliferation and Adipogenic Transdifferentiation of Porcine Muscle Satellite CellsLEI Yuhang1，2#，TAN Ya1，2，3#，HUANG Zhiyang1，2，ZHAO Mengying1，2，QI Jing3，GAN Mailin1，2，SHEN Linyuan1，2*，ZHU Li1，2*（1.Farm Animal Genetic Resources Exploration and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2.College of Animal Science and Technology in Sichuan Agricultural Univercity/Key Laboratory of Livestock and Poultry Biomics，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Chengdu 611130，China；3.Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Guizhou Academy of Agricultural Science，Guiyang 550005，China）Abstract:【Objective】The purpose of this study was to investigate the effects of acetyl-CoA carboxylase （ACACA）on proliferation，apoptosis and transdifferentiation of porcine muscle satellite cells（MSCs）.【Method】MSCs were cultured in vitro in this study to mimic the formation of porcine intramuscular fat.The ACACA gene sequence was used to design three small interfering RNAs，and the siRNA with the greatest amount of interference was chosen for transfection using quantitative real-time PCR（qRT-doi：10.16036/j.issn.1000-2650.202209180收稿日期：2022-09-27基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFD1200801）；四川省科技计划项目（2021ZDZX0008、2021YFYZ0007、2021YFYZ0030、scsztd-2022-08-09）；国家生猪技术创新中心资助。作者简介：雷宇航，硕士研究生；谭娅，助理研究员，研究方向为猪的遗传与分子育种，E-mail：Tanya_L。#为并列第一作者。*责任作者：沈林園，博士，副教授，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：；朱砺，教授，博士研究生导师，主要从事猪遗传育种研究，E-mail：。四川农业大学学报第 41 卷 PCR）.The proliferation，apoptosis，and formation of lipid droplets of MSCs were assessed by qRT-PCR，CCK-8 cell proliferation assay，flow cytometry，oil Red O staining，and triglyceride（TG）detection techniques after successfully inhibiting the expression of ACACA in MSCs.【Result】The results showed that after ACACA interference in the proliferation phase，the expression levels of the cell cycle marker gene Cyclin D1（P0.05），Cyclin E（P0.000 1），and the anti-apoptotic gene Bcl-2（P0.05）were down-regulated，while the expression level of the pro-apoptotic gene BAX（P0.05）was up-regulated in MSCs.MSCs had the capacity to transdifferentiate into adipocytes following the induction of adipogenic transdifferentiation，and ACACA interference significantly decreased the number of lipid droplets in MSCs（P0.000 1）.【Conclusion】The presented results indicated that the MSCs proliferation and apoptosis were inhibited by the ACACA gene interference，which also prevented the formation of lipid droplets during adipogenic transdifferentiation.The findings provided experimental guidelines and fundamental information for further research on the impact of ACACA on intramuscular fat and the control mechanism of pork products.Keywords:acetyl-CoA carboxylase （ACACA）；porcine skeletal muscle；primary muscle satellite cells；siRNA；transdifferentiation中国不仅是世界上生猪饲养规模最大的国家，而且还是世界最大的猪肉消费国，猪肉品质在很大程度上决定了生猪行业经济效益及产业发展，因此提高猪肉质量成为该行业重中之重亟需解决的问题1。一般意义上，猪肉品质包含pH值、嫩度、系水力以及肌内脂肪含量等指标2。在影响猪肉品质的诸多因素中，肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）含量是一项关键指标，它与猪肉的嫩度、风味、多汁性都具有明显关联3。肌内脂肪组织又俗称“大理石纹”，属于肌肉脂肪中的一种，由散布在肌纤维束之间的脂肪细胞组成，是衡量肉类营养和风味的重要指标4。目前普遍认为猪肉最佳肌内脂肪含量在2%3%之间，当肌内脂肪含量高于3%时，猪肉口感变得太过油腻会降低消费者购买意愿；而肌内脂肪含量太低则会导致猪肉品质下降，因此合理控制肌内脂肪含量成为了本行业的研究重点5-6。有研究显示猪肌内脂肪包括肌纤维内的脂滴沉积在肌纤维之间和肌纤维束之间的脂肪，其发育和代谢过程与身体其他部位的脂肪有明显的差别7。肌肉中能分化为脂肪细胞的干细胞有两种，即脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）和肌肉卫星细胞（MSCs）。这两种细胞之间存在密切联系，其中ADSCs能够分泌一些调控因子，调控MSCs增殖以及向脂肪细胞转分化8-10。另外，在胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤和罗格列酮等成脂诱导因子的作用下，体外培养的间充质来源不同的细胞（包括卫星细胞）同样能够向脂肪细胞分化11-13。这些研究表明肌内脂肪既可由肌肉内前体脂肪细胞发育而来，也可通过MSCs转分化为脂肪细胞这一调控机制进行，并且肌内脂肪含量与MSCs的增殖和成脂转分化过程息息相关14-16。ACACA属于羧化转移家族的成员，是脂肪酸代谢过程中的关键因子，其序列753-818处有生物素/硫辛酸附着位点17。该酶在哺乳动物中以两种方式存 在，分 别 为 ACACA 基 因 编 码 的 ACC-1 以 及ACACB 基因编码的 ACC-2，两者具有高度的相似性，互为同工酶。其中ACC2主要存在于脂肪分化活跃的组织，其作用是催化脂肪酸的氧化；而ACC-1主要存在于哺乳动物肝脏和脂肪组织内，能参与脂肪酸合成代谢，催化乙酰辅酶A羧化成不饱和脂肪酸合成起始产物，即丙二酰辅酶 A18。丙二酰辅酶A是线粒体内氧化的重要调控因子，充当不饱和脂肪酸合成的限速酶，可直接影响人类的脂类代谢19-22。在前期本研究团队已经证实ACACA在高肌内脂肪含量的猪群体中呈现高表达趋势23。另外据相关研究表明，ACACA 基因在高肌内脂肪含量的莱芜猪肌肉中的表达量明显高于肌内脂肪含量低的DLY猪，ACACA与肌内脂肪含量呈现正相关24。D.Gallardo等25研究也发现，在杜洛克猪中ACACA基因的两个连锁同义突变对肌肉中脂肪酸组成（包括多不饱和/饱和脂肪酸比值）有显著影响，这些研究均提示ACACA与猪肌内脂肪有相关性。因此，本研究