高丽槐素与水溶性磷酸盐柱[...的制备、表征及分子模拟研究_陶欣.pdf

第 51 卷分析化学（FENXI HUAXUE）研究报告第 2 期2023 年 2 月Chinese Journal of Analytical Chemistry219228DOI:10.19756/j.issn.0253-3820.221469高丽槐素与水溶性磷酸盐柱6芳烃包合物的制备、表征及分子模拟研究陶欣张郡童杨云汉杨举苏丽娇陈艳杨明坤杨丽娟*(云南民族大学化学与环境学院，云南省高校智能超分子化学重点实验室，生物基材料绿色制备技术国家地方联合工程中心，昆明 650500)摘要以水溶性磷酸盐柱6芳烃（PP6A）为主体，天然药物高丽槐素（MAA）为客体，采用饱和溶液法构建了一种新型的主客体包合物 MAA/PP6A。以包合物的载药量为指标，通过正交试验优化 MAA/PP6A 包合物的制备工艺；采用荧光光谱法、扫描电子显微镜（SEM）、X-射线粉末衍射（XRD）和傅里叶红外光谱（FT-IR）对 MAA/PP6A 包合物进行表征；运用核磁共振、分子模拟对接、半经验分子轨道法研究了 MAA 与PP6A 包合物的包合模式。正交实验结果表明，包合物的最优制备条件为：PP6A 与 MAA 物质的量之比为21，温度为 50，制备时间为 8 h，乙醇与水的体积比为 11。荧光光谱滴定结果表明，MAA 与 PP6A 之间的包合比为 11，并且主客体之间有较强的相互作用；采用非线性最小二乘曲线拟合法计算得到主客体络合常数为 2.458104L/mol；分析测试结果表明，MAA/PP6A 包合物已制备成功；MAA 与 PP6A 形成包合物后，其水溶性从 0.3463 mg/mL 提高至 6.123 mg/mL，有效改善了 MAA 的水溶性。半经验分子轨道法和分子对接计算结果表明，主客体之间存在弱相互作用，MAA 进入 PP6A 的空腔中形成构象稳定的包合物，PP6A是 MAA 的良好宿主，最优包合模式与核磁共振研究结果一致。关键词 高丽槐素；水溶性磷酸盐柱6芳烃；包合行为；分子对接；分子动力学高丽槐素（Maackiain，MAA）属于黄酮类化合物，可从苜蓿、车轴草和锦鸡儿等植物中分离提取得到1-3。研究表明，MAA 可有效抑制人类的单胺氧化酶，用于治疗阿尔茨海默、帕金森和抑郁症等疾病4，可抑制破骨细胞的分化及有效治疗和预防骨质溶解、疏松和骨坏死5，具有抗癌6-7、抗肿瘤8以及抗菌活性，能够有效抑制大肠杆菌、葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等病原菌的分裂生长9。MAA 还是一类新兴的抗过敏化合物10，并且利尿效果明显，在治疗腰膝酸痛、肾虚和慢性肝炎等病症方面疗效明显11-12。但是，MAA 水溶性较差，性状不稳定，易变质13，因而在新型药物制剂方面的应用受到很大制约，亟需找到一种合适的药物载体。大环主体分子因具有较好的生物兼容性和主客体性能14-15，常用于构建生物医用材料16。柱芳烃作为新一代的超分子大环主体分子17-18，以其优异的性能在纳米材料、超分子聚合物和药物转运等领域广泛应用19-21。在众多衍生化柱芳烃中，水溶性柱芳烃因其疏水的刚性空腔和亲水的边缘22，在新型药物载体的选择和应用中备受青睐23。Wheatd 等24构建了水溶性柱6芳烃与盐酸美金刚、盐酸氯已定盐的超分子体系，并应用于人正常细胞和卵巢癌细胞的毒性检测。Duan 等19利用水溶性柱6芳烃的特性，将其作为米托蒽醌的药物载体，此载药体系在酸性条件下实现了药物分子的快速释放。Zhou等25利用水溶性柱6芳烃和两亲性偶氮苯共聚物构建了双重刺激响应的化合物囊泡，实现了抗癌药物盐酸阿霉素的快速释放，并且表现出比游离药物更低的细胞毒性。本研究以水溶性磷酸盐柱6芳烃（Water-soluble phosphate salt pillar6arene，PP6A）作为 MAA 的药物载体，制备了 MAA/PP6A 主客体包合物，包合模式如图 1 所示。研究了 PP6A 与 MAA 包合过程中的2022-09-22 收稿;2022-12-08 接受国家自然科学基金项目(No.21762051)、云南省兴滇人才支持计划项目、云南省高校有机功能分子及材料科技创新团队项目和研究生基金项目(No.2022SKY031)资助。*E-mail:荧光变化和络合比。通过扫描电子显微镜（SEM）、X-射线粉末衍射（XRD）、红外光谱（FT-IR）对MAA/PP6A 包合物进行表征，通过核磁共振、半经验分子轨道法和分子模拟对接探讨了 MAA 与 PP6A可能的包合模式。本研究为天然药物分子 MAA 的新型药物制剂的研发提供了一种新思路。1实验部分1.1仪器与试剂NOVA NANOSEM-450 扫描电子显微镜（SEM，美国 FEI NanoPorts 公司）；TTR 18 KW 转靶 X-射线衍射仪（日本理学株式会社公司）；Nicolet IS10 红外光谱仪（美国 Thermo Fisher 公司）；UV-26001 紫外-可见分光光度计（日本 SHIMADZU 公司），Aglient CARY ECLIPS 荧光分光光度计（美国 NYSE：A 公司）；DF-101S 恒温磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限公司）；FA1004 分析天平（上海津平科学仪器有限公司）；Bruker Avance 400 核磁共振仪（瑞士布鲁克公司）。1,4-二（2-羟基乙氧基）（C10H14O4，95.00%）、四溴化碳（CBr4，97.00%）、多聚甲醛（CH2O）n，96.00%）、三氟化硼乙醚（BF3C2H5OC2H5，46.50%）、亚磷酸三乙酯（C6H15O3P，98.00%）、三甲基溴硅烷（C3H9BrSi，98.00%）、氨水（25.00%）和 KBr（光谱纯）均购于泰坦科技有限公司；MAA（C16H12O5，99.70%）购于辰光生物科技有限公司。1.2实验方法1.2.1水溶性磷酸盐柱6芳烃的合成参照文献21的方法合成 PP6A，对 PP6A 进行 NMR 表征，所得谱图数据与文献报道一致。产物PP6A 为淡黄色固体，产率 98.20%，1H NMR（400 MHz，D2O，ppm）：6.93（s，12H），4.10（m，24H），3.88（s，12H），2.10（m，24H）；13C NMR（100 MHz，D2O，ppm）：150.3，129.0，116.8，65.4，29.3，28.3。1.2.2MAA/PP6A包合物的制备工艺筛选采用饱和溶液法26制备 MAA/PP6A 的包合物，按照不同的物质的量之比准确称取 PP6A 与 MAA，采用不同比例的无水乙醇与水作为溶剂，在一定温度下，用水将 PP6A 溶解，将 MAA 的乙醇溶液逐滴缓慢加入到 PP6A 溶液中，避光搅拌，旋转蒸发除去溶剂后，加入适量水除去不溶物，真空干燥 24 h，得到棕色固体物质 MAA/PP6A 包合物。正交试验以载药量为评价指标，以 PP6A 与 MAA 的物质的量之比（A）、包合温度（B）、包合时间（C）和乙醇与水的体积比（D）为因素，每个因素取 3 个水平，选用 L9（34）设计正交试验。1.2.3MAA/PP6A包合物与物理混合物的制备采用筛选后的最优制备工艺合成 MAA/PP6A 包合物。按照相同的物质的量之比分别准确称取化合物 MAA 和 PP6A，将其充分混匀，置于真空干燥箱中干燥 24 h，得 MAA 与 PP6A 的物理混合物。Water-soluble phosphatesalt pillar6arenel(PP6A)Saturate solustion methodInclusionMaackiain(MAA)Inclusion complexOptimal inclusion mode图1MAA（MAA）与水溶性磷酸盐柱6芳烃（PP6A）的结构及二者包合物（MAA/PP6A）形成示意图Fig.1Structure of maackiain(MAA)and water-soluble phosphate salt pillar6arene(PP6A)and schematicdiagram of the formation of MAA/PP6A inclusion complex220分 析 化 学第 51 卷1.2.4MAA与PP6A的主客体包合模拟计算采用 Gaussian View 构建 MAA 的初始结构，并用 B3LYP/6-31G（d）将 MAA 的结构优化至几何平衡；同时，采用 Gaussian View 修改取自剑桥晶体数据库中的全甲氧基柱6芳烃，得到 PP6A 的结构，用 PM6-D3H4 方法优化 PP6A 的结构。选用坐标放置法构建 MAA 与 PP6A 的包合过程：以柱芳烃桥联亚甲基碳构成圆的圆心作为坐标原点 O，将 MAA 分子中未与羟基相连的苯环中心点作为定位点 m，将 m 与 O 之间的距离定义为 Dm-o，使 MAA 分子从距离坐标原点的+1 nm 移动到1 nm，每步移动 0.05 nm，共 40 步，每移动一步均采用 PM6-D3H4 方法对主客体包物结构进行全优化。量化计算采用 Gaussian 03 程序完成27，半经验计算采用 MOPAC2016 软件包完成28。通过分子对接模拟，进一步对 MAA 与 PP6A 的主客体包合模式进行深入探究，以 MAA 为配体分子，PP6A 为刚性受体分子，将格点间距设置为 60 点60 点40 点，网格间距为 0.0375 nm，设置最大评估数为 2.5 106，执行 100 次构象搜索，将 MAA 对接到 PP6A 的空腔中，并对构象的 RMSD 不超过 0.2 nm 的进行聚类分析，分子对接采用软件 AutoDock 4.2 完成29。2结果与讨论2.1MAA/PP6A的制备工艺优化分析采用 1.2.2 节实验方法设计正交试验，以无水乙醇将定量的 MAA/PP6A 包合物超声溶解，测定其最大吸光度值，并通过标准曲线方程计算得到包合物中 MAA 的含量30，再计算载药量（包合物中 MAA 的质量占包合物的质量的百分比），并以此为评价指标。以 PP6A 与 MAA 的物质的量之比（A）、包合温度（B）、包合时间（C）和乙醇与水的体积比（D）为因素，选用四因素三水平设计正交试验，正交试验的分析结果见表 1，方差分析见表 2。由表 1 可知，4 个因素对包合物载药量的影响为 ADBC，即 PP6A 与 MAA 的物质的量之比乙醇表1正交试验设计与结果Table 1Design and results of orthogonal test序号Serial numberAB/C/hD载药量Drug loading capacity/%111(1)30(1)6(1)11(1)49.88211(1)40(2)8(2)12(2)46.21311(1)50(3)10(3)14(3)64.11412(2)30(1)8(2)14(3)51.79512(2)40(2)10(3)11(1)53.39612(2)50(3)6(1)12(2)44.39721(3)30(1)10(3)12(2)62.03821(3)40(2)6(1)14(3)69.99921(3)50(3)8(2)11(1)75.40K1160.2163.7164.3178.7K2149.6169.6173.4152.6K3207.4183.9179.5185.9R57.8520.2015.2733.26表2方差分析Table 2Analysis of variance因素Factor偏差平方和DEVSQ自由度Degree of freedomF 值F-value显著性SignificanceA632.1216.05p 0.01B71.9321.827C39.3721.000D204.025.1810.01 p 包合温度包合时间。由表 2 可知，因素 A 在不同水平间存在显著性差异（p 0.01），A 为重要的影响因素；D 因素在不同水平间有差异（0.01 p 0.05），为次要影响因素。综合考