高花青苷同源四倍体紫菜薹新材料的创制及特性分析_李孟杰.pdf

核 农 学 报 2023，37（5）：08970906Journal of Nuclear Agricultural Sciences高花青苷同源四倍体紫菜薹新材料的创制及特性分析李孟杰1 张晨1 王美云1 杨晓雪1 侯喜林1，2 王建军1 周鸿章3 刘同坤1，*（1南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/园艺作物种质创新与利用教育部工程研究中心，江苏 南京 210095；2南京苏曼等离子工程研究院，江苏 南京 210095；3南京理想农业科技有限公司，江苏 南京 210095）摘要：为获得优质高花青苷的同源四倍体不结球白菜紫菜薹 Lcx025b 新材料，本研究利用浓度为0.2%（w/v）的秋水仙素溶液处理二倍体Lcx025b幼苗的子叶生长点，通过形态学、细胞学、流式细胞仪测定等方法筛选鉴定得到同源四倍体植株，通过农艺性状指标、营养品质、光合特性、抗病能力等方面对二、四倍体植株进行比较分析。结果表明，相较于二倍体植株，四倍体植株在形态学方面表现出巨大性，具体表现为叶片的长宽比显著减小，叶片趋于扁圆形，花器官、种荚、种子等明显增大，菜薹颜色加深；叶片气孔明显增大，气孔密度减小；花粉粒表现出明显不规则性；四倍体植株根尖细胞染色体的数目以及通过流式细胞仪分析的四倍体植株DNA的荧光强度都表现为二倍体的两倍；营养品质方面，可溶性糖、菜薹花青苷含量显著增加，纤维素、硝态氮含量显著减少，可溶性蛋白、叶绿素含量无显著变化；结合光响应曲线分析，四倍体光合能力更强，适应性更高；此外，在抗病性鉴定过程中，四倍体植株对灰霉菌的抗性明显优于二倍体植株。综上，本研究获得了高花青苷的同源四倍体不结球白菜紫菜薹Lcx025b新材料，为不结球白菜的种质资源创新提供了重要的材料支撑。关键词：紫菜薹；同源四倍体；光合特性；抗病性；特性分析DOI：10.11869/j.issn.1000-8551.2023.05.0897不结球白菜（non-heading Chinese cabbage Brassica campestris（syn.Brassica rapa）ssp.chinensis）起源于我国，主要包括两种类型：叶用类型的青菜、小白菜等，薹用类型的菜心、紫菜薹等1。紫菜薹又称红菜薹，属于十字花科芸苔属植物芸薹的变种蔬菜作物，主要分布在我国长江流域一带，以幼嫩菜薹为食，其茎薹紫红、色泽艳丽、口感甜脆、风味独特，加之薹用不结球白菜营养价值比叶用不结球白菜更为丰富，近年来在江浙沪地区越来越受到种植户和消费者的欢迎。随着对紫菜薹育种工作的不断深入，紫菜薹的栽培面积愈发广泛，是我国蔬菜栽培生产的重要组成部分2。天然多倍体植株发生频率较低，不易被发现和选择利用，多倍体育种技术是采用人工干预的形式让植物染色体成倍增多来获得多倍体材料3。随着植物育种技术和多倍体诱导技术的不断发展，常采取人工诱导的方法提高多倍体的发生频率，扩大遗传变异范围，从而创造丰富的植物多倍体类型。植物多倍体人工诱导方法主要包括物理诱导法、化学诱导法、细胞融合法等4。其中物理诱导法主要包括嫁接、超声波和射线处理，但因此类方法容易导致嵌合率高且易发生基因突变，在目前生产上未能普及利用4。化学诱导法主要是采用化学试剂来诱导产生多倍体，其中以秋水仙素诱导效果最好而被广泛应用5。适宜浓度的秋水仙素能阻碍正在分裂的细胞内纺锤丝形成，阻止染色体向两极移动，形成染色体加倍的细胞核，此过程不仅对染色体的构造无明显影响，且能保持细胞的正常活性。目前，秋水仙素已成功诱导出黄瓜6、木薯7、百合8等植物的多倍体植株。在园艺植物品种选育中，多倍体育种具有特殊意义。对于园艺植物蔬菜作物来说，由于多倍体具有优良特性，与二倍体相比，四倍体所表现的营养物质含量高、抗逆性强、品质优良、丰产等特征，使多倍体育种在文章编号：1000-8551（2023）05-0897-10收稿日期：2022-06-27 接受日期：2022-07-31基金项目：国家自然科学基金面上项目（32072575），江苏省种业揭榜挂帅项目（JBGS 2021 015）作者简介：李孟杰，男，主要从事不结球白菜多倍体育种研究。E-mail：*通讯作者：刘同坤，男，教授，主要从事蔬菜晚抽薹分子生物学和多倍体育种研究。E-mail：897核农学报37 卷 蔬菜作物上的应用更加广泛。武娅歌等9利用秋水仙素对二倍体欧洲温室型黄瓜进行诱导，获得了欧洲温室型黄瓜同源多倍体新种质，为黄瓜种质创新与欧洲温室型新品种选育奠定了基础；张咪等10利用秋水仙素诱导不结球白菜五月慢，获得了同源四倍体植株新材料；祝园园11利用秋水仙素诱导月季二倍体无菌苗茎段，成功获得了种质优良的四倍体新品种。花青苷是植物特有的黄酮类天然色素，主要积累在植物的叶片、果实以及花瓣中，赋予植物不同的颜色12。此外，花青苷具有抗氧化及清除自由基的功能，可作为食品添加剂在食品着色应用方面发挥天然、安全、健康的效果13。许多园艺植物中富含花青苷，具有较高的营养价值，使得选育富含花青苷的食用蔬菜品种受到广泛关注14。不结球白菜品种Lcx025b的主要食用器官紫菜薹外表皮为紫色，相比于普通绿菜薹品种，其在营养品质方面具有富含花青苷等优势，但目前广泛种植的紫菜薹品质有待进一步提高，急需创制优质新种质以满足市场对于高品质紫菜薹的需求。为获得更为优质的高花青苷紫菜薹Lcx025b新材料，本研究采用秋水仙素诱导二倍体植株获得同源四倍体植株，旨在培育高产、优质的紫菜薹新材料，为不结球白菜紫菜薹育种研究提供丰富的种质资源。1材料与方法1.1试验材料本试验材料不结球白菜紫菜薹 Lcx025b（2n=2x=20）由南京农业大学园艺学院白菜系统生物学实验室提供。试验于2020年9月至2022年5月在南京农业大学白马教学科研基地进行。1.2不结球白菜同源四倍体诱导方法参考吴婷等15的方法，用0.2%（w/v）的秋水仙素溶液诱导处理二倍体幼苗的子叶生长点，于每天9：00和17：00各处理一次，共处理5次，每次用量20 L；对照组用蒸馏水进行处理。1.3多倍体鉴定方法1.3.1 形态学鉴定 对植株形态进行初步鉴定，以同生长期二倍体紫菜薹Lcx025b植株为对照，观察经秋水仙素处理后的植株的株型、生长势、开展度，叶片形状及颜色变化、花器官等形态学性状的变化。若有明显差异，则鉴定为多倍体疑似植株。1.3.2 解剖学鉴定 解剖学鉴定主要包括气孔鉴定和花粉鉴定16。气孔鉴定：选取二倍体和外部形态有变异的四倍体疑似植株的同时期叶片，避开叶脉部分用胶带撕取叶片下表皮放置在载玻片上，并用刀片刮去或者水流冲去多余的叶肉细胞，置于光学显微镜下观察气孔大小及密度是否具有明显差异。花粉鉴定：取同花期花粉状况良好的二倍体和四倍体疑似植株的花粉，将花粉粒涂抹在载玻片上，置于光学显微镜下观察，比较花粉粒的大小和形态。1.3.3 细胞学鉴定 参考丰国蕊等17的方法，将疑似同源四倍体植株的种子放置培养皿上进行催芽处理，待根长至11.5 cm时切取根部浸泡至0.002 molL-1 8-羟基喹啉溶液中进行预处理3 h左右，之后加入卡诺固定液（V无水乙醇 V冰乙酸=3 1，现配现用）于4 冰箱固定9 h左右，后用1 molL-1盐酸于60 下水浴锅解离4 min，用改良卡宝品红染液染色制片，在正置 DM6B荧光显微镜（Leica，德国）下观察拍照。1.3.4 流式细胞仪分析 称取约0.1 g新鲜幼嫩的叶片材料，避开叶脉，平铺于-20 预冷的培养皿上，加入1.5 mL预冷的解离液（200 mmolL-1 Tris、4 mmolL-1 MgCl46H2O、0.5%（v/v）TritonX-100 配制而成，调节pH值至8.0，置于4 冰箱保存），用锋利的单面刀片一次性快速将叶肉组织切碎成微小颗粒状。将滤液经500目的尼龙过滤网过滤至50 mL离心管中，之后转移至2 mL离心管中。向2 mL离心管中加入35 L的碘化丙啶染色液（propidium iodide，PI），再加入 10 L RNase（10 mgmL-1，现配现用，避光保存）。充分混匀，静置于冰上避光染色15 min，上机检测并分析鉴定疑似同源四倍体植株的DNA含量，以二倍体植株DNA含量作为对照，每组设置3次重复18。1.4二、四倍体不结球白菜紫菜薹Lcx025b农艺性状统计和营养品质测定将经鉴定确认为四倍体植株Lcx025b的M0代单株套袋自交授粉，并单株收种。将M1代种子于2021年9月 22日播种于南京农业大学白马教学科研基地，于2022年1月5日测定农艺性状指标。随机选取10株二、四倍体生长势大致相同的植株，统计株高、植株开展度、叶片数、叶片长宽、十叶厚、叶柄长宽厚等农艺性状。随机各选取3株生长时期及长势相同的二、四倍体植株，取每株植物大致相同部位的新鲜叶片，测定可溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素、硝态氮以及纤维素含量等营养指标，花青苷含量以二倍体紫菜薹为对照进行测定19。1.5二、四倍体不结球白菜紫菜薹Lcx025b的光合特性分析参考陆建农等20方法于晴天上午 9：0011：00，采用 LI6800 光合作用全自动测量系统（LI-COR，美国）进行测定，用CO2小钢瓶注入系统为光合反应提供8985 期高花青苷同源四倍体紫菜薹新材料的创制及特性分析CO2底物，测定前进行校准，确保控制样品室内CO2浓度稳定。设定CO2浓度为400 molmol-1，测定其在0、10、30、50、70、100、150、200、300、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000 molm-2s-1光照强度下单位面积净光合速率（net photosynthetic，Pn）、气孔导 度（stomatal conductance，Gs）、胞 间 CO2浓 度（intercellular，Ci）、蒸腾速率（transpiration，Tr），从二、四倍体中分别随机选取6株，每株选取生长情况大致相同的叶片进行测定。参考刘阳阳等21对光响应模型研究的方法，利用非直线双曲线模型对光合曲线进行拟合，结合SPSS软件进行非线性回归22，根据非线性拟合结果得到光饱和点（light saturation point，LSP）、光补偿点（light compensation point，LCP）、最大净光合速率（maximun net photosynthetic rate，Pmax）、表观量子 效 率（apparent quantum yield of photosynthesis，AQY）、暗呼吸速率（dark respiration rate，Rd）等重要的光合参数。1.6二、四倍体不结球白菜紫菜薹Lcx025b的抗病性测定1.6.1 灰霉菌小孢子悬浮液的制备及侵染 在无菌条件下将灰霉菌菌种（由浙江大学农业与生物技术学院师恺教授提供）接种在V8固体培养基（36%V8果汁，2%琼脂，0.2%CaCO3）上进行继代培养，25 C条件下避光培养一周左右。待培养皿内长满孢子后，在超净工作台无菌环境下将菌丝刮下置于孢子悬浮液（1%蛋白胨，4%麦芽糖）中，剧烈震荡以充分释放孢子，经尼龙网过滤后，采用血球计数板将孢子浓度调至1107个 mL-1。选取二、四倍体同生长时期新鲜嫩叶，将离体叶片置于含有湿润滤纸的培养皿中，将孢子悬浮液点滴在叶片上避开叶片边缘和叶脉，每滴10 L，12 h/12 h光暗交替、光强为400 molm-2s-1、25 C恒温的培养箱中培养23 d，期间要保持培养皿内具有较大的湿度，每个处理取 3 棵植株叶片设置 3 次重复，观察叶片发病情况。1.6.2 总RNA的提取、纯化和cDNA的合成 于接种3 d后，取二、四倍体叶片病斑周围的组织约0.1 g样品于液氮中用磨样机研磨，用北京天根生化科技有限公司提供的植物总 RNA 提取试剂盒提取 RNA。按照HifairR V one-step RT-gDNA digestion SuperM