阿莫西林颗粒中有关物质高效液相色谱分析方法的建立_郑如程.pdf

安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Jul，27（7）阿莫西林颗粒中有关物质高效液相色谱分析方法的建立郑如程1，田胜2，程正1，江跃2，张德兵2作者单位：1铜陵市食品药品检验中心，安徽 铜陵244061；2安徽安科恒益药业有限公司，安徽 铜陵244061基金项目：安徽省药品监督管理局2021年度科技创新项目（AHYJ-KJ-202121）摘要：目的 建立高效液相色谱法测定阿莫西林颗粒中的有关物质。方法 2021年6月至2022年2月，采用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C8（4.6 mm 250 mm，5 m）；流动相A为0.05 mol/L磷酸缓冲液（取0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液，用20%氢氧化钠溶液调节pH至5.5），流动相B为0.05 mol/L磷酸缓冲液（取0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液，用20%氢氧化钠溶液调节pH至4.5）-乙腈（84 16）；进行梯度洗脱；检测波长为230 nm；流速为2.0 mL/min。结果 建立了用于分析阿莫西林颗粒中有关物质的高效液相色谱方法，该方法下主峰与各杂质峰间分离良好，各杂质成分在各自线性范围内与峰面积线性关系良好（r0.999），专属性、重复性、精密度、稳定性、耐用性均符合要求。结论 该法专属性强、准确度和重复性好，可作为检测阿莫西林颗粒中有关物质的有效方法。关键词：阿莫西林；药物污染；有关物质；高效液相色谱；梯度洗脱Establishment of high performance liquid chromatography method for the determination of related substances in amoxicillin granulesZHENG Rucheng1,TIAN Sheng2,CHENG Zheng1,JIANG Yue2,ZHANG Debing2Author Affiliations:1Tongling Institutes for Food and Drug Control,Tongling,Anhui 244061,China;2Anhui Anke Hengyi Pharmaceutical Co.,Ltd,Tongling,Anhui 244061,ChinaAbstract：Objective To establish a high performance liquid chromatography method for the analysis of related substances in amoxicillin granules.Methods The high performance liquid chromatography method was performed on Agilent Zorbax SB-C8(4.6 mm 250 mm,5 m)column from June 2021 to February 2022;The mobile phase A was 0.05 mol/L phosphate buffer(0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution,pH adjusted to 5.5 with 20%sodium hydroxide solution),mobile phase B was 0.05 mol/L phosphate buffer(0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution,pH adjusted to 4.5 with 20%sodium hydroxide solution)-acetonitrile(84 16);gradient elution;the detected wavelength was 220 nm;the flow rate was 2.0 mL/min.Results A high performance liquid chromatography method was established for the analysis of related substances in amoxicillin granules.The impurities and main components were effectively separated,and the impurity components had a good linear relationship with the peak area in their respective linear range(r0.999).The specificity,repeatability,precision,stability and durability all met the requirements.Conclusion This method is suitable for determination of the related substances of Amoxicillin granules.Key words：Amoxicillin;Drug contamination;Related substance;High performance liquid chromatography(HPLC);Gradient elution阿莫西林（Amoxicillin）称羟氨苄青霉素，其为白色或类白色的结晶性粉末，稍有特异的气味和苦味，是第二代青霉素的主要品种，系广谱半合成抗生素，具有广谱抗菌作用，世界卫生组织（WHO）推荐本品作为首选的-内酰胺类口服抗生素，在口服抗生素中占有重要的位置1。本品临床上应用于革兰阴性菌、革兰阳性菌等所致的感染性疾病、呼吸系统疾病及泌尿系统疾病2-5。由于其高效、低毒，因此在临床上应用十分广泛，但其不良反应发生率居各类药物之首。为了减少不良反应的发生6-7，必须对其杂质进行控制。阿莫西林原料8-9、阿莫西林注射剂10-11、阿莫西林胶囊12-14中的杂质研究已有不少文献报道，但对阿莫西林颗粒15-16中杂质的研究相对较少。经检索各国药典，现行 中华人民共和国药典（ChP）2015年版和 2020年版中“阿莫西林颗粒”标准中未收录“有关物质”检查项17-18，国外药典中也未收载有阿莫西林颗粒剂，其相似剂型为“阿莫西药物分析引用本文：郑如程，田胜，程正，等.阿莫西林颗粒中有关物质高效液相色谱分析方法的建立 J.安徽医药，2023，27（7）：1324-1331.DOI：10.3969/j.issn.1009-6469.2023.07.011.1324安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Jul，27（7）林口服混悬剂”，但均未控制有关物质，其中美国药典USP41“阿莫西林口服混悬剂”征求意见稿19中控制了“有关物质”检查项，但正式稿及美国药典USP4220中均未控制。本研究于2021年6月至2022年2月，结合原料药生产工艺，检索各国药典，阿莫西林目前已知的杂质共有17个（见表1）。其中杂质H与杂质P这两种杂质在原料合成工艺中不产生，阿莫西林颗粒制剂中将不再研究；杂质N为工艺杂质和副产物，是6-APA与杂质D的缩合物，杂质O为降解产物，是杂质D与阿莫西林的三聚合物，两者在聚合物测定中可予以控制，故按照其他单个杂质控制；对可以获得对照品的杂质 A、B、C、D、E、F、G、I、J、K、L、M、D-HPM这13种杂质在阿莫西林颗粒中进行了研究，对实验条件进行了优化，使阿莫西林颗粒中主成分与各杂质可实现良好分离；并进行相关的方法学验证。1仪器与试药SQP QUINTIX 224-1CN电子天平（德国赛多利斯集团），S210型pH计（瑞士梅特勒-托利多集团），LC-20A型高效液相色谱仪（二极管阵列检测器，日本岛津公司）。阿莫西林颗粒（A公司：批号S200301，S200302，S200303；L 公司：批号 1903A0，9420），阿莫西林对照品（中国食品药品检定研究院，批号 130409-201512，含量86.9%），阿莫西林工作对照品（A制药公司，批号190121034，含量87.1%），阿莫西林系统适用性对照品（中国食品药品检定研究院，批号130608-201804），杂质 A（中国食品药品检定研究院，批号 130595-201001，含量 100%），杂质 B（USP对照品，批号R081J0，含量100%），杂质C（USP对照品，批号R072H0，含量100%），杂质D（USP对照品，批号R051S0，含量100%），杂质E（美国CATO公司，批号 C4X-11486-1708，含量 95.6%），杂质 F（USP 对照品，批号 R074A0，含量 100%），杂质 G（USP 对照品，批号R019S0，含量100%），杂质I（中国食品药品检定研究院，批号 130435-201903，含量 99.9%），杂质J（美国CATO公司，批号161-12-6，含量90.1%），杂质K（美国CATO公司，批号C4X-114816-1812，含量 97.7%），杂质 L（加拿大 TRC 公司，批号 2-JPD-178-1，含量95%），杂质M（加拿大TRC公司，批号4-JPD-26-1，含量90.0%），D-HPM（美国CATO公司，批号166-12-23，含量98.7%）。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，试验用水由Milli-Q系统制备。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax SB-C8 柱（4.6 mm250 mm，5 m）；鬼峰捕集小柱：Welch Ghost-Buster Column（4.6 mm50 mm，5 m）；流动相A为6.8 g/L磷酸二氢钾溶液（用20%氢氧化钠溶液调节pH至5.50.1）；流动相B为6.8 g/L磷酸二氢钾溶液（用20%氢氧化钠溶液调节pH至4.50.05）-乙腈（84 16）；按表 2 进行梯度洗脱程序；检测波长230 nm；柱温30；流速2.0 mL/min；低温进样器温度4；进样量20 L；溶剂为流动相A。2.2溶液配制供试品溶液：取A公司阿莫西林颗粒适量，精密称定，冷水中用流动相A溶解并定量稀释制成每1毫升中约含阿莫西林1.5 mg的溶液，滤过，取续滤液即得。对照溶液：精密量取供试品溶液 1 mL，置 100 表1阿莫西林各杂质汇总一览表序号123456化学名6-氨基青霉烷酸L-阿莫西林2，5，-二酮哌嗪-2-阿莫西林阿莫西林噻唑酸阿莫西林脱羧噻唑酸3-（4-羟基苯基）吡嗪-2-醇杂质代号阿莫西林杂质A阿莫西林杂质B阿莫西林杂质C阿莫西林杂质D（D1和D2为顺反异构体）阿莫西林杂质E（E1和E2为顺反异构体）阿莫西林杂质F序号789101112化学名D-（4-羟苯基）甘氨酰阿莫西林（2R）-2-（2，2-二甲基丙基）氨基-2-（4-羟基苯基）乙酸（2R）-2-氨基-2-（4-羟基苯基）乙酸阿莫西林闭环二聚体阿莫西林开环二聚体6-APA阿莫西林酰胺杂质代号阿莫西林杂质G阿莫西林杂质H阿莫西林杂质I阿莫西林杂质J阿莫西林杂质K阿莫西林杂质L序号1314151617化学名阿莫西林开环酸阿莫西林开环脱羧酸二聚体6-APA阿莫西林开环酸酰胺阿莫西林开环三聚体N-新戊酰基阿莫西林（R）-甲基-2-氨基-2-（4-羟苯基）乙酸盐酸盐杂质代号阿莫西林杂质M阿莫西林杂质N阿莫西林杂质O阿莫西林杂质PD-对羟基苯甲氨酸甲酯盐酸盐（简称D-HPM）1325安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Jul，27（7）mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇