东北红豆杉内生真菌Fusa..._J8的鉴定及抗菌活性研究_傅岳峰.pdf

基金项目:黑龙江省自然科学基金联合引导项目(编号:LH2021C015);黑龙江头雁创新团队计划(林木遗传育种创新研究团队);森林生态系统可持续经营教育部重点实验室基金(编号:KFJJ2021YB01)科研园地东北红豆杉内生真菌 Fusarium tricinctum J8 的鉴定及抗菌活性研究傅岳峰1，徐铖1，魏巍1，崔海超1，宋金凤2，顾成波1，2(通信作者)，袁肖寒3(通信作者)1东北林业大学 化学化工与资源利用学院 森林植物生态学教育部重点实验室 林业生物制剂教育部工程研究中心 黑龙江省林源活性物质生态利用重点实验室(哈尔滨 150040);2东北林业大学林学院 森林生态系统可持续经营教育部重点实验室(哈尔滨 150040);3 东北农业大学 生命科学与生物技术研究中心(哈尔滨 150030)摘要目的:从东北红豆杉内生真菌中筛选出一株对常见致病细菌具有广谱拮抗活性的菌株。方法:以大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌 4 种常见致病细菌为指示菌，采用滤纸片扩散法筛选具有广谱抗菌活性的内生真菌，基于形态观察与系统发育分析对该菌株进行种属鉴定，利用高效液相色谱(HPLC)分析该菌株不同发酵时间次级代谢产物的代谢情况，通过超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱高分辨质谱(UPLCQOrbitrapMS/MS)分析该菌株可能产生的抗菌物质。结果:通过筛选获得一株广谱拮抗菌株 J8，鉴定为三线镰刀菌(Fusarium tricinctum)，根据 HPLC 色谱图对比，确定最佳培养时间为 8 天，通过 mzCloud 数据库比对分析其质谱数据，发现该菌株产生环(脯氨酸亮氨酸)二肽、环(脯氨酸苏氨酸)二肽、恩镰孢菌素 B1、曲酸 4 种匹配度大于 90%的抗菌物质。结论:从东北红豆杉中获得了一株对 4 种常见致病细菌均具有抑菌活性的菌株 Fusarium tricinctum J8，为开发新型抗生素候选药物提供了菌种资源。关键词:东北红豆杉;内生真菌;三线镰刀菌;抗菌活性中图分类号:2841文献标识码:A文章编号:10062882(2023)0349705DOI:1014035/jcnkihljyy202303001Identification and Antimicrobial Activity of Endophytic FungusFusarium tricinctum J8 from Taxus CuspidateFu Yuefeng1，et al1Key Laboratory of Forest Plant Ecology of Ministry of Education，Heilongjiang Provincial Key La-boratory of Ecological Utilization of ForestryBased Active Substances，Engineering esearch Centerof Forest BioPreparation of Ministry of Education，College of Chemistry，Chemical Engineeringand esource Utilization，Northeast Forestry University(Harbin Heilongjiang 150040)Abstract Objective:To screen a strain with broad spectrum antagonistic activity against common pathogenic bacteria from the en-dophytic fungi of Taxus cuspidate Methods:Four common pathogenic bacteria were used as indicators to screen endophytic funguswith broadspectrum antibacterial activity by filter paper diffusion method The specie of the strain was identified based on mor-phological observation and phylogenetic analysis HPLC was used to analyze the abundance of fungal secondary metabolites incrude extracts on different days to determine the optimal fermentation days UPLCQOrbitrapMS/MS was used to detect thepossible antibacterial substances produced by the strain esults:Endophytic fungus J8 was screened by antibacterial test and i-dentified as Fusarium tricinctum According to the comparison of HPLC chromatograph，the optimal culture time was determinedto be 8 days The mass spectrum data were compared and analyzed by mzCloud database，and 4 antibacterial active substances794黑龙江医药Heilongjiang Medicine Journal Vol36 No3 2023with matching degree greater than 90%were found Conclusion:Fusarium tricinctum J8，a strain with with broadspectrum anti-bacterial activity，was selected from endophytic fungi of Taxus cuspidate，which provides strain resource for the development ofnew antibiotic drugsKey words:Taxus cuspidate;Endophytic fungi;Fusarium tricinctum;Antimicrobial activities植物内生真菌是指存在于健康植物组织内部并不会对宿主植物造成明显不良影响的一类微生物1。由于其特殊的生存环境，在与宿主植物长期协同进化的过程中形成了特殊的代谢体系，使其能够产生活性多样、结构新颖的次级代谢产物，有些内生真菌还能够产生与宿主细胞相同或相似的活性成分23。自从 Stierle 等在 1993 年从短叶红豆杉的韧皮部分离到一株产紫杉醇的内生真菌 Taxomyces andreanae以来，从植物内生真菌次级代谢产物中寻找活性成分一直备受关注4。到目前为止，已从植物内生真菌中分离出生物碱类、萜类、黄酮类、环肽类等次生代谢产物56，它们具有抗菌、抗癌、抗病毒等多种生物活性78。大量研究表明，从植物内生真菌中分离得到的次级代谢产物大多具有显著的抗细菌活性9。因此，从植物内生真菌中筛选具有广谱抗菌活性的菌株对寻找抗菌药物或新型活性成分具有重要意义。红豆杉属植物因其能够产生抗癌药物紫杉醇而受到广泛关注，是公认的天然珍稀抗癌植物10。我国共有中国红豆杉、西藏红豆杉、云南红豆杉、南方红豆杉以及东北红豆杉5 种红豆杉，其中东北红豆杉主要生长于我国东北部，是国家一级珍稀濒危保护树种，其根、茎、叶以及树皮均可入药，东北红豆杉的叶具有治疗小便不利、肾炎浮肿等功效11。因东北红豆杉长期生长在环境寒冷的恶劣条件下而生长缓慢，但在漫长的生长过程中其几乎不受病虫害的影响，这可能是因为其自身含有抗菌抗虫害的物质。目前对其内生真菌的研究主要集中于特异性产紫杉醇的内生真菌上，而对其内生真菌的抗菌活性却鲜有研究。本研究以 4 种常见致病菌为指示菌，对前期从东北红豆杉中获得的内生真菌进行抗菌活性筛选，以期获得一株具有广谱抗菌活性的菌株，通过形态学观察和分子生物学鉴定方法确定其种属，利用 UPLCQOrbitrapMS/MS 分析其次级代谢产物中可能存在的抗菌成分。本研究有助于探明东北红豆杉特异性内生真菌作为抗菌微生物资源的潜力，为新型抗菌候选药物的开发奠定基础。1材料与方法11菌种真菌菌种:内生真菌由本课题组前期从东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室药用植物园(哈尔滨)东北红豆杉中分离获得并保存。常见致病菌:大肠杆菌(Escherichia coli)、白色念珠菌(Candida albicans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)均为本实验室保藏菌株。12试验试剂LB 肉 汤 培 养 基(LB);马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基(PDA);马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB);乙酸乙酯(分析纯);乙腈、甲醇(色谱级)。13仪器设备赛默飞世尔高分辨质谱仪 Thermo ScientificTMExactiveTMPlus Orbitrap;安捷伦高效液相色谱仪 Agilent Technologies1260 infinity;旋转蒸发仪 FO2B;生物洁净工作台 DLCJ2N;恒温摇床。2实验方法21东北红豆杉内生真菌的活化将用 20%甘油保存在80 冰箱的东北红豆杉内生真菌取出，吸取 200L 菌液涂布于 PDA 培养皿上，28培养 3天，用无菌打孔器取得含有菌丝的琼脂块置于新的 PDA 培养皿上，28倒置培养 714 天。22东北红豆杉内生真菌抗菌特性的筛选采用滤纸片扩散法对内生真菌抗菌活性进行测试。用无菌打孔器取两个带有菌丝的琼脂块置于 200mL PDB 培养基中，于 28、150rpm 的条件下在恒温振荡培养箱中培养 6天后将发酵液用四层纱布过滤，使菌丝与菌液分离，菌液中加入等体积乙酸乙酯萃取 3 次，于旋转蒸发仪上 30 减压蒸发至干得粗提物，用适量甲醇溶解后经 022m 微孔有机滤膜过滤，置于 4冰箱中备用。将 4 株常见致病菌分别接入到灭菌 LB 液体培养基中，置于恒温摇床 30、180rpm 培养 24h，将其适当稀释后吸取200L 涂布于 LB 固体培养基上。在每个无菌滤纸片上滴加20L 菌株粗提物，用无菌镊子夹到已加好供试菌株的 LB 固体培养基上，30恒温培养 24h 后观察。23内生菌株 J8 的鉴定231形态学鉴定将菌株 J8 在 28下培养 714 天，观察菌落的颜色、质地、表面形态、溶出物和生长速度，通过光学显微镜观察菌丝和孢子的形态特征，参考真菌鉴定手册 内容对其种属进行初步鉴定。232分子生物学鉴定将活化好的内生真菌 J8 接种到PDB 培养基中，恒温摇床 28、150rpm 条件下培养 3 4 天后收集菌丝体备用。利用天根真菌基因组 DNA 试剂盒提取菌株 J8 基因组 DNA。以提取的总 DNA 为模板，使用引物ITS1(5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3)和 ITS4(5 TC-CTCCGCTTATTGATATGC3)扩增，通过 1%琼脂糖电泳检测并回收扩增产物，将纯化后的产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序。将测序结果进行 Blast(https:/www894黑龙江医药Heilongjiang Medicine Journal Vol36 No3 2023ncbinlmnihgov/)比对分析，使用 MEGA7 中的 NeighbourJoining 法构建系统发育进化树。24内生真菌 J8 最