结核病病原菌实时荧光PCR检测方法 GBT 27639-2011.pdf

GB/T27639-2011表1荧光PCR引物与探针序列类别核酸序列上游引物：5GCA GGG TTC GCC TAC GTG3结核分枝杆菌复合下游引物：5CGG GTC CAG ATG GCT TGC3群(1S6110)探针：5-FAM-TGT CAC CGA CGC CTA CGC TCG C3-BHQ-1上游引物：5CCA GGA ACG CCT CAA CC3结核分枝杆菌复合下游引物：5CGA CGA GGC GGA TGA TC3样(1S1081)探针：5-FAM-AGA GGT ACG ACG CCG AAC CGA C-BHQ-1上游引物：5CGG TGT AAT CAG TTT TGA AGC3结核分枝杆菌下游引物：5CGA TTG GAA CGG CGA AGC3探针：5-FAM-TAG GTA GTC CAG TAG AGC CCC ATA GCC A3-BHQ1上游引物：5ACG CCT TCC TAA CCA GAA TTG3牛分枝杆菌下游引物：5GGC TAT TGA CCA GCT AAG ATA TCC3探针：5-FAM-AAT TCA TAC AAG CCG TAG TCG TGC AGA A3-BHQ-1探针5端标记的报告荧光基团及3端标记的淬灭基团可根据荧光PCR仪设备等具体情况另行选定。5材料与试剂5.1仪器与耗材5.1.1接种棒。5.1.2无菌注射器或真空采血管。5.1.3灭菌容器。5.1.4橡胶管。5.1.5刮匙。5.1.6级生物安全柜。5.1.7荧光PCR仪。5.1.8恒温水浴锅（室温至100）。5.1.9离心机（最高离心力达15000g以上）。5.1.10混匀器。5.1.11冰箱(28，-20，-80)。5.1.12天平（精密度达千分之一以上）。5.1.13微量可调移液器(10L,100L,1000L)。5.1.14微量带滤芯吸嘴(10L,100L,1000L)。5.1.15研钵。5.1.16离心管。5.1.17PCR光学反应管。5.2试剂5.2.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682一2008规定的二级水，所用化学试pGB/T27639-2011剂均为分析纯。5.2.2引物与探针：采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针（序列见表1）配制成100mol/L储存液，置一20或更低温度冻存：使用时取适量配制成10mo/几工作液，避免多次冻融。5.2.30.01mol/LpH7.6PBS:配方见A.1。5.2.4柠檬酸钠缓冲液：配方见A.2。5.2.50.5mol/L EDTA:配方见A.3,5.2.6柠檬酸钠-磷酸缓冲液：配方见A,4。5.2.74%氢氧化钠溶液：配方见A.5。5.2.84%硫酸溶液：配方见A.6。5.2.9 Triton X-100.5.2.10DNA提取液：含100mmol/L Tris-HCI(pH8.0),0.01%Triton X-100,200g/L蛋白酶K。也可采用等效商品化试剂。5.2.11灭菌双蒸水，5.2.12三氯甲烷。5.2.13异丙醇。5.2.14无水乙醇。5.2.1570%乙醇：用新开启的灭菌双蒸水配制，一20预冷。5.2.16荧光PCR反应级冲液：含50mmol/LKC1,10mmol/L Tris-HC1(pH8.3),2.5mmol/LMgC12,5%二甲基亚砜(DMSO),5%甘油。可采用等效商品化试剂。5.2.17dNTP:dATP、dUTP、dCTP和dGTP。5.2.18Tq酶，5.2.19UDG酶。6生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB19489一2008的有关规定。7采样7.1样品采集7.1.1细菌培养物直接取液体培养基培养的菌液：对于在固体培养基上生长的菌落，用接种捧挑取适量（取用量达到肉眼可见，菌团大小不超过接种环)菌样，放到0.01mo/LpH7.6PBS中，振荡混匀形成悬浮菌液。7.1.2血样用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，无菌分离血清。用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0.5mol/L EDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂，条件允许时，建议优先采集全血，以更有利于富集菌体。7.1.3奶样无菌采集奶液于灭菌的容器中。一般以后段奶液含菌量较多，早晨挤出的奶液含菌量最高。