狂犬病诊断技术 GBT 18639-2002.pdf

GB/T18639-200230min。3.4.3取出玻片，用磷酸盐级冲盐水轻轻冲去玻片上多余的染色液，再将玻片连续通过3缸（或杯）磷酸盐缓冲盐水，每缸浸泡3min,并不时轻轻振汤。最后在蒸馏水中浸泡3min。3.4.4在吸水纸上轻轻磕尽玻片上的蒸馏水，自然干燥后，于标本区上滴加1滴甘油缓冲液（分析纯中性甘油9份，pH7.4磷酸盐缓冲盐水11份)，覆盖玻片扣于载玻片上，然后镜检。3.5对照设置3.5.1已知狂犬病病毒标本片加狂犬病荧光抗体染色应有特异荧光出现。3.5.2已知狂犬病病毒标本加狂犬病未标记抗体阻抑后，再加狂犬病荧光抗体染色，应无特异荧光出现。3.5.3已知狂犬病病毒阴性标本片加狂犬病荧光抗体染色，应无特异荧光出现。3.6荧光显微镜检查及判定一般用蓝紫光，激发滤光片用BG2,吸收滤光片用OG,或GG以满足异硫氰酸荧光黄的荧光谱要求为准。暗视野聚光器比明视野聚光器易于观察特异性荧光。物镜浸油须用无荧光镜油，也可以封片用的甘油级冲液代替。先检查对照标本。只有在对照标本的染色结果符合3.5.13.5.3要求时才能去检查被检标本。特异性荧光呈亮绿至黄绿色，背景细胞染成淡黄或橙红色，细胞核成暗红色。狂犬病特异性荧光颗粒较大，数量不等，位于细胞浆内，凡在神经细胞胞浆内发现特异性荧光，均应判为狂犬病病毒感染者。4小鼠和细胞培养物感染试验4.1材料准备4.1.1器材：细胞培养瓶（或管），二氧化碳恒温箱，微量超滤器（滤膜孔径0.45m),微量组织研磨器，普通离心机及离心管，0.25mL注射器及针头等。4.1.2试剂：0.5%水解乳蛋白汉克氏(Hanks)液，伊格尔氏(Eagle)最低要素培养液(EMEM),犊牛血清，200001U/mL青霉素溶液，20000g/mL链霉素溶液等。4.1.3小鼠：无特定病原(SP)易感小鼠，57日龄（也可用34周龄者，但发病时间可能稍推迟）。4.1.4仓鼠肾传代细胞(BHK2)或小鼠神经母细胞瘤(NAC1300)细胞。4.2样品的采取和运送除可按照2.2的方法和要求送检新鲜脑组织外，还应采集睡液送检。方法是：用灭菌吸管吸取或用灭菌棉拭棒薄取腮腺口附近的睡液，置人1ml2mL内含2%灭活豚鼠血清和抗生素的Hanks液中，低温保存备用。4.3样品的处理脑组织用组织研磨器磨碎，加0.5%水解乳蛋白Hanks液制成20%(m/W)混悬液，以3000r/min离心30min,吸取上清液，加入青毒素5001U/mL和链毒素500g/mL,在4C处理3h4h,即可用于感染小鼠和细胞培养物的接种样品。唾液样品亦需经上述离心和杀菌处理。怀疑有污染的样品，可用0.45m微孔滤膜过滤法处理。4.4感染方法4.4.1小鼠感染法每份样品用小鼠46只。左手固定小鼠，在耳与眼之间用碘酒消毒。右手特吸取接种样品的0.25mL注射器在消毒部位刺入硬脑膜下，每只小鼠注射0.03mL。对照小鼠2只，按同法同剂量注射稀释液（即0.3%水解乳蛋白Haks液）。每天早晚各观察1次，记录是否有发病小鼠。至少观察28d。4.4.2细胞培养物感染法每份样品接种46管细胞培养物。取接近长成单层的细胞培养物用Haks液轻洗3次，每管接种样品0.1mL0.2mL,在37C恒温箱内吸附1h,用Hanks液洗1次（亦可不洗）加入含有1%2%轶