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高原短期暴露通过重构肠道微...鼠束缚应激所致肠道炎性反应_张栩绯.pdf
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高原 短期 暴露 通过 肠道 束缚 应激 所致 反应 张栩绯
现代消化及介入诊疗2022 年 第27 卷 第12 期Modern Interventional Diagnosis and Treatment in Gastroenterology 2022,Vol27,No121531基础研究高原短期暴露通过重构肠道微生态环境预防小鼠束缚应激所致肠道炎性反应张栩绯1,王鹤松2,李昊1,马海林1【摘要】目的探讨短期高原暴露对小鼠束缚应激所致的肠道炎症反应和肠道菌群的影响。方法将 C57BL/6 小鼠随机分为对照组(Control 组)、束缚应激组(S 组)、高原暴露组(HA 组)和高原暴露束缚应激组(HA-S 组)。HA 组和 HA-S 组暴露于模拟海拔 3500 4000 m 的低压氧舱中 14 天。从第 28 35 天开始,S 组和 HA-S 组进行束缚应激。测定不同组别小鼠回肠肿瘤坏死因子-、白细胞介素(IL)-1、IL-4、IL-6、IL-10 和干扰素-,并进行 16S rNA 高通量测序检测肠道菌群。结果HA 组肠道炎症水平与 Control 组无显著差异,HA-S 组小鼠肠道炎症水平显著低于 S 组小鼠;16S rNA 测序结果显示,四组间肠道菌群存在差异,其中双歧杆菌属和 Muribaculaceae 在干预过程中发挥积极影响。结论高原短期暴露可能通过脑 肠轴改变肠道菌群结构并重塑肠道微生态环境,以预防小鼠束缚应激所致的肠道炎症性反应,而双歧杆菌和毛杆菌科菌可能是这一过程中潜在的益生菌。【关键词】短期高原暴露;肠道微生态;束缚应激;肠道炎症;脑 肠轴中图分类号:574文献标志码:ADOI:10 3969/j issn 1672 2159 2022 12 009作者单位:1 850000 西藏大学高原脑科学研究中心;2 510500 南方医科大学南方医院白云分院通信作者:马海林,E-mail:David_ma79163 com基金项目:西藏自治区科技计划项目(XZ202201YD0018C);西藏自治区科技计划项目(XZ202201ZY0027G)Short-term exposure to high altitude prevented intestinal inflammatory response induced by restraint stress in mice byreconstructing intestinal microecological environmentZHANG Xu-fei1,WANG He-song2,LI Hao1,MA Hai-lin11 Plateau Brain Science esearch Center,Tibet University,Lhasa,850000,Tibet,China;2 Baiyun Branch,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou,510500,Guangdong,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of short-term exposure to high altitude on intestinal inflammation caused byrestraint stress and intestinal microbiota in mice MethodsC57BL/6 mice were randomly divided into control group(Control group),restraint stress group(S group),high altitude exposure group(HA group)and high altitude exposure with restraint stress group(HA-S group)HA and HA-S groups were exposed to a low pressure oxygen chamber at a simulated altitude of 3500 4000 m for 14 daysFrom day 28 to 35,the S and HA-S groups were subjected to restraint stress Ileal tumour necrosis factor-,interleukin(IL)-1,IL-4,IL-6,IL-10,and interferon-were measured in different groups of mice,and 16S rNA high-throughput sequencing wasperformed esultsThe level of intestinal inflammation in the HA group was not significantly different from that in the Control group,and the level of intestinal inflammation in the mice in the HA-S group was significantly lower than that in the mice in the S group 16SrNA sequencing showed that there were differences in intestinal microbiota between the four groups,with Bifidobacterium andMuribaculaceae playing a positive role in the intervention ConclusionShort-term exposure to high altitude may change the structureof intestinal microflora through the brain-gut axis,thus reconstruct the intestinal microecological environment,and prevent the intestinalinflammatory response caused by confinement stress in mice Bifidobacterium and Trichinella may be potential probiotics in thisprocess【Key words】Short-term high altitude exposure;Intestinal microecology;estraint stress;Intestinal inflammation;Brain-gut axis高原具有特殊的地理和气候条件,其中低氧水平被认为是高海拔环境对人体影响最大的因素,会影响消化系统、心血管系统、神经系统以及外源性物质的代谢1 2 等。有研究表明,边缘系统、海马和前额叶皮质等与记忆相关的脑区对缺氧非常敏感,高原暴露对个体的工作记忆功能有显著影响3 4。另一方面,高原环境会对大鼠小肠组织造成损伤,可改变肠道微生物的组成和活性5,但对肠道菌群的影响因海拔高度和暴露时间而异。近年来,脑 肠轴理论受到广泛关注,胃肠道1532现代消化及介入诊疗2022 年 第27 卷 第12 期Modern Interventional Diagnosis and Treatment in Gastroenterology 2022,Vol27,No12和大脑之间的双向信号传导对维持内环境稳态至关重要,与应激相关的症状如焦虑、肠易激病和炎症性肠病6 之间的紧密联系进一步证明了这一轴的重要性。然而,高原环境暴露如何通过脑 肠轴途径影响肠道微生态环境的作用机制尚未明确。小鼠受束缚条件影响会产生心理应激行为,并引发一系列肠道炎症7。因此,本研究基于脑 肠轴理论,利用低压氧舱模拟海拔 3500 4000 m 环境,应用 16S rNA 测序技术,检测肠道菌群发生显著变化的“关键物种”,研究短期高原暴露对小鼠束缚应激所致肠道炎症的影响,进一步探索肠道微生物在脑 肠轴中的调控作用。1材料与方法1 1动物处理及取样48 只 8 周龄 C57BL/6 小鼠购自 SPF(北京)生物技术有限公司,适应 1 周后(预适应 1 周后第 1 天为第 1 天)分为 4组,分别为对照组、束缚刺激(S)组、高原暴露(HA)组、高原暴露+束缚刺激(HA-S)组。Control 组和 S 组空气压力维持在 94.5 kPa,HA 组和 HA-S 组暴露于模拟海拔 3500 4000 m的低压氧舱中 14 天,舱内空气压力设置为 60 65 kPa,低压氧舱内的温度和湿度与舱外相同,舱室每天开放一小时,供应食物和水。实验 14 天内,各组小鼠均正常饮食和饮水。所有动物均饲养在温度保持在 22 2和 12/12 h 光/暗循环(暗期:晚上7 点 早上7 点)的室内。所有动物实验均按照四川农业大学机构动物关爱使用委员会批准的 实验动物饲养使用指南(批准文号:SYXKchuan2019-187)进行。从第 28 天到第 35 天,S 组和 HA-S 组小鼠被置于 50 mL的塑料锥形离心管中 6 小时,并通过将它们的头部朝向有气孔的圆柱体的鼻端进行束缚刺激。这些管子限制了动物的所有身体活动,而不会引起疼痛。所有小鼠在束缚刺激实验期间不提供食物和水。完成束缚刺激实验后,从 4 个实验组中随机选取 10 只小鼠,按照动物护理机构指南进行颈椎脱位处死。收集小鼠回肠内容物进行后续 16S rNA 基因测序,并进行炎症因子检测。1 2生化分析使用小鼠专用试剂盒(上海酶联生物科技有限公司),通过 ELISA 法测定回肠中的炎症因子含量。测定的炎症因子包括白细胞介素-1(Interleukin-1eta,IL-1)、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-)和干扰素-(Interferon-gamma,IFN-)。1 316S rNA 基因测序与分析采用 E Z N A 粪便 DNA 试剂盒(Omega BioBio-Tek,Norcross,GA,USA)提取粪便总基因组 DNA。采用琼脂糖凝胶电 泳 和 NanoDrop NC2000 分 光 光 度 计(Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)分别检测提取 DNA 的质量和数量。用 1 L DNA 模板、5 L 缓冲液(5 )、0.25 L Fast PfuDNA 聚合酶(5 U/L)、2 L(2.5 mM)脱氧核苷三磷酸、正反向引物各1 L(10 M)、14.75 L 双蒸馏水对细菌16S rNA基因 V3-V4 区进行 PC 扩增。将样本特异性的 7-bp 条形码分别插入正向引物 338F(59-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-39)和反向引物 806(59-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-39)中进行测序。热循环过程如下:初始变性(98,5 min),变性(98,30 s),退火(53,30 s),延伸(72,45 s),最终延伸(72,5 min)。其中,变性、退火、拉伸共进行 25 个循环。PC扩增使用 Vazyme VAHTSTM DNA Clean beads(Vazyme,南京,中国),并使用 Quant-iT PicoGreen 双链 DNA 检测试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行定量。在上海派森诺生物技术有限公司(中国上海)使用 Illumina MiSeq 平台进行 2250-bp 对端测序。使用 QIIME2-2022 2(https:/

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