转基因产品检测 核酸定性PCR检测方法 GBT 19495.4-2004.pdf

GB/T19495.4-2004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法1范围GB/T19495的本部分规定了转基因产品检测的核酸定性PCR方法。本部分适用于种子、句料、食品和环境样品中转基因成分的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T19495的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T19495.1一2004转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2一2004转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3一2004转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.5一2004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法GB/T19495.7一2004转基因产品检测抽样和制样方法3术语和定义见GB/T19495.1确立的术语和定义适用于本部分，4防污染措施按照GB/T19495.2一2004的规定执行。5抽样和制样按照GB/T19495.7一2004规定的方法执行，6原理6.1一般原理定性分析包括对测试样品目标核酸序列的筛选检测和（或）特异性检测。在设置合适的对照和在检测下限的情况下，定性检测结果要清楚判断样品是否为转基因产品。本检测方法包括：目标序列的扩增和检测：扩增片段特异性的确证，6.2PCR扩增目标序列的扩增是在反应缓冲液中，脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在DNA聚合酶的作用下进行的催化反应。在反应混合体系中不应存在DNA聚合酶的抑制剂。DNA扩增是一个循环的过程：一通过加热使双螺旋DNA变性成为单链核酸；一在合适的温度下引物和目标序列发生退火反应：一在合适的温度下，结合在两条单链上的引物通过DNA聚合酶作用进行PCR延伸反应。6.3PCR产物检测和确证可以通过凝胶电泳或其他方法检测PCR产物，必要时可以将PCR产物从凝胶中分离出来进行1GB/T19495.4-2004检测。可以通过限制性内切酶酶切分析、杂交、DNA序列分析或熔点曲线分析等方法对PCR产物进行确证。采用实时荧光PCR方法检测时，扩增及检测同时进行。7试剂7.1将PCR反应液分装成小包装，每次取部分进行反应测试，其余溶液保存在一20。7.2模板DNA/对照。7.3水。7.4dNTP溶液，含有dATP,dCTP,dGTP,dTTP。7.510PCR缓冲溶液。7.6耐热的DNA聚合酶(Taq酶)。7.7正向引物。7.8反向引物。8仪器设备见GB/T19495.1一2004.9检测步骤9.1一般性要求测试样品中DNA的提取和含量测定应按照GB/T19495.3一2004中的规定执行。每个实验室样品应制备成2个测试样品提取DNA,测试实验应设立PCR抑制剂对照，PCR抑制剂对照的设置见GB/T19495.1一2004。对样品进行DNA提取时要保证DNA的质量和浓度的稳定，以保证PCR反应的可重复性。要确保提取的DNA片段大于扩增片段。9.2PCR要求和操作9.2.1操作准则具体的检测方法见本标准的附录A至附录D.9.2.2扩增反应的一般要求反应条件，特别是镁高子浓度以及热循环条件要针对每个引物和体系进行优化。对于特定的样品首次使用某一引物体系时，要证实所采用的循环条件不出现竞争性产物，以免降低PCR检测的敏感度。当模板DNA分子大于10个拷贝时，一个标准的PCR反应在40个循环之内就能得到可检测的PCR产物。随着循环数的增加，非特异性PCR产物也增加。一个优化的PCR反应要确保能使100个拷贝的参照样品的目标模板DNA在40个PCR扩增循环内得到可检测的PCR产物。对于不同的引物要严格控制其反应温度和（或）时间，同时也要严格控制不同仪器所采用的反应混合液。9.3PCR反应设计9.3.1一般要求由于不同特异PCR反应结果之间要有可比性，并且在进行复合PCR和竞争PCR检测时，母个特异PCR之间会相互发生作用，9.3.2扩增片段的大小待扩增目标片段大小的选择应与研究样品DNA的分子大小相匹配。如从加工食品中得到的变性DNA,扩增产物理想的范围为60bp150bp:对于未经加工的食品，扩增产物片段可以长一些，如：250bp左右。只要通过预实验验证能得到大小不同的打增片段的引物是可行的，那么这些引物就可应