致病性嗜水气单胞菌检验方法 GBT 18652-2002.pdf

GB/T18652-2002前言嗜水气单胞菌在自然界中广泛分布，有致病性菌株和非致病性菌株之分。致病性菌株可感染鱼类两牺类、爬行类、乌类和哺乳类等动物，包括脚、团头鲂、链，铺、鲤、鲛、草鱼、香鱼、狼鲈、虹鳟、尼罗罗非鱼、斑点叉尾、黄谱、日本鳗、欧洲鳗、翘嘴鳜、牛蛙、美洲鳄、中华鳖、貂、貉、兔、猪、牛等，临床上以急性出血性败血症为主要特征。慢性感染则主要表现为皮肤溃疡或肠炎。人亦可因致病性嗜水气单胞菌感染而发生腹泻及食物中毒。本标准在嗜水气单胞菌的鉴定中，参考了伯杰氏鉴定细菌学手册（第九版，1994）中有关嗜水气单胞菌的内容。在嗜水气单胞菌的分离鉴定中，除采用选择培养基RS培养基及鉴别培养基嗜水气单胞菌(AHM)培养基外，还应借助一些生化反应将其与假单胞菌、邻单胞菌、肠杆菌、弧菌及其他气单胞菌进行区分。蛋白酶是嗜水气单胞菌重要的毒力决定因子，与该菌的致病性密切相关，凡蛋白酶阳性的嗜水气单胞菌均具致病性。蛋白酶的检测除采用脱脂奶平板法外，还可采用斑点酶联免疫试验。本标准可用于嗜水气单胞菌的分离鉴定，而且可区分致病性菌株和非致病性菌株，有助于致病性嗜水气单胞菌感染的确切诊断。本标准的附录A、附录B是标准的附录，附录C是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出，本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：南京农业大学动物医学院。本标准主要起草人：陆承平、陈怀青。中华人民共和国国家标准GB/T18652-2002致病性嗜水气单胞菌检验方法Methods for detection of pathogenic aeromonas hydrophila1范围本标准规定了致病性嗜水气单胞菌的检验方法。本标准适用于患病鱼类等易感动物及水样中致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定，也可用于送检菌株的鉴定。2致病性嗜水气单胞菌检验程序检脸程序的流程示意图见附录C(提示的附录)。2.1嗜水气单胞菌的分离2.1.1准备2.1.1.1各种培养的制备方法见附录A(标准的附录)。2.1.1.2各种试剂的制备方法见附录B(标准的附录)，2.1.2待检样本待检样本可包括病料、水样及送检菌株，病料既可是无菌采取的易感动物的肾、肝、脾等未污染病料，也可是粪便或病变皮肤等污染病料，如样本为菌株，应先接种于普通肉汤（见附录A中A1),28C培养24h,再划线接种于普通琼脂平板（见附录A中A2),使之形成单个菌落，以供鉴定用。2.1.3分离2.1.3.1未污染病料的分离2.1.3.1.1接种环（铂金耳）火焰灭菌，冷却。2.1.3.1.2用接种环蘸取病料。2.1.3.1.3划线接种于普通琼脂平板。2.1.3.1.428C培养24h.2.1.3.2污染病料的分离2.1.3.2.1接种环（铂金耳）火焰灭菌，冷却。2.1.3.2.2用接种环蘸取病料。2.1.3.2.3接种于RS琼脂平板（见附录A中A3)。2.1.3.2.428C培养24h。2.1.3.3水样的分离：2.1.3.3.1用孔径为0.2m的硝酸纤维素微孔滤膜过滤水样。2.1.3.3.2取出滤膜，置含有灭菌碱性蛋白陈水（见附录A中A4)的试管中。2.1.3.3.328C培养24h.2.1.3.3.4划线接种于普通琼脂平板。2.1.3.3.528C培养24h.中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准2002-05-01实施GB/T18652-20022.2嗜水气单胞菌的鉴定2.2.1菌落形态嗜水气单胞菌在普通琼脂平板上，28C培养24h后的菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡黄色，有特殊芳香气味。2.2.2氧化酶试验2.2.2.1用铂金耳挑取普通琼脂平板上单个菌落少许。2.2.2.2涂布于浸有1%盐酸四甲基对苯胺（见附录B中B1)的滤纸片上。2.2.2.310s内观察细菌涂布处的颜色，2.2.2.4若细菌涂布处出现红色，判为阳性。2.2.2.5嗜水气单胞菌应为阳性。2.2.3AHM鉴别培养2.2.31用铂金耳挑取普通琼脂平板上氧化酶试验阳性的单个菌落少许。2.2.3.2穿刺接种AHM鉴别培养基（见附录A中A5)。2.2.3.337C培养24h。2.2.3.4嗜水气单胞菌的表现为：顶部仍为紫色，底部为淡黄色，细菌沿穿刺线呈刷状生长，即运动力阳性：部分菌株顶部呈黑色。2.2.4吲引哚试验2.2.4.1在长有细菌的AHM鉴别培养基顶部，滴加34滴Kovacs试剂（见附录B中B1)。2.2.42若沿试管内壁出现红色环者，表明产生吲哚，判为阳性。2.2.4.3嗜水气单胞菌应为阳性。2.2.5革兰氏染色2.2.5.1在一干净载玻片上滴加一滴蒸馏水。2.2.5.2用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。2.2.5.3在载玻片上与蒸馏水混合并均匀涂布。2.2.5.4自然干燥，火焰固定。2.2.5.5加草酸铵结品紫染液（见附求B中B2)染1min2min。2.2.5.6流水冲洗。2.2.5.7加革兰氏碘液（见附录B中B3)作用1min2min。2.2.5.8流水冲洗。2.2.5.9加复红酒精染液（见附录B中B4)染50s60s。2.2.5.10流水冲洗，2.2.5.11千燥，镜检。2.2.5.12嗜水气单胞菌应为革兰氏阴性短杆菌。2.2.6糖发酵试验2.2.6.1用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。2.2.6.2分别接种葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷及水杨苷等5种糖发酵试验管（见附录B中B5)。2.2.6.328C培养24h.2.2.6.4凡试验管颜色从紫色变为黄色，表明细菌可发酵该种糖类，判为阳性。2.2.6.5嗜水气单胞菌可发酵以上5种糖类。2.3嗜水气单胞菌致病性鉴定2.3.1脱脂奶平板试验2.3.1.1用铂金耳取AHM鉴别培养基表面菌落少许。2.3.1.2接种划线于1%脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板（见附录A中A6)。2