食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GBT 4789.28-2003.pdf

1CS07.100.30C53中华人民共和国国家标准GB/T4789.28一2003代替GB/T4789.28一1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂Microbiological examination of food hygiene-Stainning methods,culture mediums and reagents2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会发布GB/T4789.28-2003前言本标准对GB/T4789.28一1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂进行修订。本标准与GB/T4789.28一1994相比主要修改如下：一按照GB/T1.1一2000对标准文本的格式进行修改。一删去4.78中的高盐察氏培养基。本标准自实施之日起，GB/T4789.28一1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人：周桂莲、刘宏道、罗雪云、李风琴，付萍。本标准于1984年首次发布，1994年第一次修订，本次为第二次修订GB/T4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂1范围本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。本标准适用于食品和食物中毒样品中各类微生物的检验。2染色液配制及染色法2.1美蓝染色法2.1.1吕氏碱性美蓝染色液美蓝0.3g95%乙醇30 mL0.01%氢氧化钾溶攸100mL将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。2.1.2染色法将涂片在火焰上固定，待冷。滴加染液，染1min一3min,水洗，待干，镜检。2.1.3结果菌体呈蓝色2.2革兰氏染色法2.2.1结晶紫染色液结品紫1g95%乙醇20 mL1%草酸铵水溶液80 mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。2.2.2革兰氏碘液茶1g碘化钾2g蒸馏水300 mL将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。2.2.3沙黄复染液沙黄0.25g95%乙醇10mL蒸馏水90m将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸棉水稀释。2.2.4染色法2.2.4.1将涂片在火焰上固定，滴加结品紫染色液，染1mi,水洗。2.2.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗，2.2.4.3滴加95%乙醇脱色，约30s:或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。GB/T4789.28-20032.2.4.4水洗，商加复染液，复染1min。水洗，待干，镜检。2.2.5结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注：亦可用1：10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10$.2.3耐酸性染色法（萋-倪二氏法）2.3.1石炭酸品红染色液碱性品红0.3g95%乙醇10 mL5%酚水溶液90 mL将品红溶解于乙醇中，然后与酚溶液混合。2.3.23%盐酸-乙醇浓盐酸3 mL95%乙醇97 mL2.3.3复染液吕氏碱性美蓝染色液。2.3.4染色法2.3.4.1将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。染液如因蒸发减少时，应随时添加。染5mi,倾去染液，水洗。2.3.4.2滴加盐酸-乙醇脱色，直至无红色脱落为止（所需时间视涂片厚薄而定，一般为1m3min),水洗。2.3.4.3滴加吕氏碱性美蓝染色液。复染30s1mi,水洗，待干，镜检。2.3.5结果：耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质呈蓝色。2.4柯氏染色法2.4.1染色液2.4.1.10.5%沙黄液。2.4.1.20.5%孔雀绿液.2.4.2染色法2.4.2.1将涂片在火焰上固定，滴加0.5%沙黄液，并加热至出现气泡，约2min3min,水洗。2.4.2.2滴加0.5%孔雀绿液，复染40s50$。水洗，待干，镜检。2.4.3结果布氏杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈绿色。2.5奥尔特氏荚膜染色法2.5.1染色液沙黄3g蒸馏水100mL用乳钵研磨溶解。2.5.2染色法将涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加热至产生蒸气后，继续染3mi。水洗，待干，镜检。2.5.3结果炭疽芽胞杆菌菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。2.6瑞氏染色法2.6.1染色液瑞氏色素0.1gGB/T4789.28-2003甲醇60 mL用乳钵研磨溶解。2.6.2染色法2.6.2.1涂片待自然干燥后，滴加染色液，固定1min。2.6.2.2加人等量蒸馏水(pH6.5),染色3min5min2.6.2.3用蒸馏水冲洗，待干，镜检。2.7鞭毛染色法2.7.1染色液的配制2.7.1.1甲液：称单宁酸5g氯化高铁(FC,)1.5g,溶于100mL蒸馏水中，待溶解后加入1%的氢氧化钠溶液1mL和15%的甲醛溶液2mL。2.7.1.2乙液：称2g硝酸银溶于100mL蒸馏水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化铵溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余10L乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止（此为关键性操作，应特别小心)。滴加氢氧化铵和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用，2d3d基本无效。2.7.2染色法在风干的载玻片上滴加甲液，4in一6min后，用蒸馏水轻轻冲净。再加乙液，缓缓加热至目汽，维持约半分钟（加热时注意勿使出现干燥面）。在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜检，菌体及鞭毛为深祸色到黑色。2.8碱性复红染色法将0.5g碱性复红染料溶解于20mL95%乙醇中，然后用蒸馏水稀释至100mL。如有不溶物时，可用滤纸过滤，或静置后取上清液备用。注：本染色液系用于苏云金芽胞内蛋白质毒素结晶的染色，霜以与蜡样芽胞杆菌相区别，3生化试验培养基和试剂3.1Hugh-Leifson培养基(O/F试验用)3.1.1成分蛋白陈2 g氯化钠5 g磷酸氢二钾0.3g琼脂4g葡萄糖10g0.2%溴麝香草酚蓝溶液12 mL蒸馏水1000mLpH7.23.1.2制法将蛋白陈和盐类加水溶解后，校正pH至7.2。加入葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入指示剂。混匀后，分装试管，121C高压灭菌15min,直立凝固备用。3.1.3试验方法从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时接种两支培养基，其中一支于接种后滴加溶化的1%琼脂液于表面，高度约1cm,于36C1培养。3.1.4结果结果见表1