2022年医学专题—流式细胞仪分析技术应用(1).ppt

实验室流式细胞仪单细胞分选技术(jsh),第一页，共五十二页。,流式细胞术(flow cytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速(kui s)、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。,第二页，共五十二页。,流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析(dnglingfnx)或纯化分选。,细胞不被破坏，测量快速、大量(dling)、准确、灵敏、定量,流式细胞术的特点(tdin),第三页，共五十二页。,（1）液流系统(xtng)（2）光学系统（3）数据处理系统,1.流式细胞仪的基本(jbn)结构：,第四页，共五十二页。,通过流式细胞仪进行(jnxng)细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行(jnxng)的。,细胞(xbo)分选原理,第五页，共五十二页。,压电晶体(jngt),产生(chnshng)机械振动,不充电(chng din),充电,（一）分选基本原理,第六页，共五十二页。,分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过(tnggu)测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。,（二）分选的技术(jsh)要求,第七页，共五十二页。,参数：FS,SS,FL数据显示方式（单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图）设门分析(fnx)技术,第二节 数据(shj)的显示与分析,第八页，共五十二页。,FS：反映颗粒(kl)的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少,一、参数(cnsh),第九页，共五十二页。,单参数(cnsh)直方图双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图三参数直方图多参数分析,直分析(fnx)方图,设门分析(fnx):REGION和GATE设置,二、数据显示方式,第十页，共五十二页。,由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成(guchng)，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（一）单参数(cnsh)直方图,第十一页，共五十二页。,单参数(cnsh)直方图,细胞(xbo)相对数量,第十二页，共五十二页。,双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号(xnho)通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（二）双参数(cnsh)直方图,第十三页，共五十二页。,1.双参数(cnsh)直方图点图,第十四页，共五十二页。,2.二维等高图,由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞(xbo)相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。,第十五页，共五十二页。,二维等高图,第十六页，共五十二页。,3.假三维等高图,第十七页，共五十二页。,（三）三参数(cnsh)直方图,第十八页，共五十二页。,多参数分析(fnx)：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析(fnx)。,（四）流式细胞仪的多参数(cnsh)分析,第十九页，共五十二页。,Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他(qt)参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。,根据门的形状又分为了线性门、矩形(jxng)门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,三、设门分析(fnx)技术,第二十页，共五十二页。,A 淋巴细胞B 单核细胞C 中性(zhngxng)粒细胞,A、B、C均为任意(rny)门,第二十一页，共五十二页。,线性门,第二十二页，共五十二页。,样本制备标记染色(rns)液相芯片技术 质量控制,第四节 流式细胞仪免疫分析(fnx)的技术要求,第二十三页，共五十二页。,外周血淋巴细胞样品的制备分离单个核细胞(xbo)培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤,一、免疫检测样品(yngpn)制备,第二十四页，共五十二页。,新鲜实体组织单细胞悬液的制备机械(jxi)法酶处理法化学试剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液的保存深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）,第二十五页，共五十二页。,1 Phosphate Buffer Saline or HBSS(Ca/Mg+free)1 mM EDTA25 mM HEPES pH 7.01%Fetal Bovine Serum(Heat-inactivated),Sorting Buffer,第二十六页，共五十二页。,淋巴细胞：1x HBSS(with Ca+/Mg+)含1%FBS HBSS配方中的阳离子可增加细胞的生存力。由于这些细胞并非易于(yy)聚集，即便配方中沒有EDTA也不会造成问题。,较黏着的细胞(sticky cells)：提高EDTA 到 5mM 并使用透析过的FBS(against Ca+/Mg+free PBS)。某些细胞在活化会比较(bjio)黏著而EDTA可抑制此作用,第二十七页，共五十二页。,贴壁型细胞株(Adherent cells)：以Trypsin处理后去准备单细胞悬液时，待细胞变圆(切记(qij)不可过度作用)，便以5 ml 含5%血清培养液收取细胞，并均匀地打散细胞悬液。离心后，用sorting buffer调整细胞浓度。如果需要的话，可以提高EDTA的浓度(至5mM)以避免細胞重新黏聚。,含有高比例死細胞的样本：Sorting buffer加5mM MgCl2以及2550 g/mL DNAase I(Sigma D-4513)或是(hu sh)Sorting buffer加0.83mM MgCl2以及20 U DNAase II(Sigma D-4138)。这些配方可減少因死细胞释放出來的DNA所造成的细胞黏聚现象。,第二十八页，共五十二页。,尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素PE-Cy5/APC&PerCP-Cy5.5/APC为弱表达(biod)的抗原选择较亮的荧光素CD62L on CD8+T防止耦联染料降解（光照/固定/升温等）造成的干扰APC-Cy7/PE-Cy7,二、常用的荧光染料与标记(bioj)染色,第二十九页，共五十二页。,尽量(jnling)选择荧光光谱重叠小的荧光素,Minimize the potential for spectral overlap Spillover estimates available in the spectra viewer,2,第三十页，共五十二页。,激光(jgung),细胞(xbo)悬液,异硫氰酸荧光(ynggung)素,得州红,能量传递复合染料,藻胆蛋白类,（一）几种常见的荧光染料,第三十一页，共五十二页。,常用(chn yn)的几类荧光染料,第三十二页，共五十二页。,用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射(fsh)波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。,能量传递复合(fh)染料,第三十三页，共五十二页。,488nm,575nm,670nm红色(hngs)荧光,花青(hu qn)苷5,藻红蛋白(dnbi),能量传递复合染料机制,第三十四页，共五十二页。,多色分析时组合抗体(kngt)的使用原则,在免疫表型分析中，常常把多种荧光素标记抗体同时组合在一起进行多色分析，但并非多种抗体均可以自由组合在一起使用。在多数荧光素标记抗体组合应用之前，必须将每种抗体单独应用和组合应用的结果进行比较，一旦这种组合显示出与单独应用时无差别的结果时，这种组合才可以应用于多色免疫表型分析。在单独或组合应用时，应注意抗体的稀释度。如3种抗体单独使用时的最佳用量为20l，而3种抗体组合应用时如果(rgu)各加20l，总体积会增至60l，因此每种抗体的浓度被稀释成原来的1/3，不再是最佳用量。因此组合抗体应用浓度应比单独抗体使用浓度高。一种新的抗体组合设计后必须进行这种比对试验，这种组合一旦应用与临床，不可随便改换抗体组合或抗体的克隆。一般情况下多色分析荧光素标记抗体组合最好采用同一种工艺制作的为佳。,第三十五页，共五十二页。,血液(xuy)系统单细胞分选标准化的建立,第三十六页，共五十二页。,背景(bijng),干细胞的研究意义现在已经越来越重要。白血病干细胞的研究一直走在整个学科的前沿，引领学科的发展。越来越多的证据显示干细胞自我更新及分化的分子机制(jzh)都是在单细胞水平上发生的，单细胞技术的发展为干细胞的研究奠定了重要基础。现有的单细胞技术主要包括单细胞分选、培养、单细胞PCR、单细胞多色Fish、单细胞基因组及表观遗传学分析、免疫缺陷鼠移植鉴定在内的单细胞技术。,第三十七页，共五十二页。,拟解决的关键科学(kxu)问题,所有的单细胞实验技术中，干细胞的单细胞分选是最为关键，也是最为基础的一个环节。影响单细胞分选效果的因素有很多。（比如目的分离(fnl)细胞群的不同，分选的仪器选择，抗体标记的染料的选择，不同荧光颜色之间的补偿计算，样品的准备，收集工具的不同等。)单细胞分选的标准化建立非常重要，尤其我重点实验室研究工作主要以血液系统为研究对象，更加有意义。,第三十八页，共五十二页。,研究(ynji)目标,通过对机器参数的调整，激光功率的确认，补偿的量化处理，接收工具的模板(mbn)化和抗体组合的优化建立一套针对白血病干细胞和正常造血干细胞的分选标准。,第三十九页，共五十二页。,研究(ynji)方法,荧光抗体的选择分选仪器的比较补偿(bchng)计算的量化精确调整接收工具的模板标准化单细胞的培养鉴定,第四十页，共五十二页。,荧光抗体(kngt)的选择,种属来源：人正常造血干细胞分选标记(bioj)：Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rholow白血病干细胞的分选标记：CD34+CD38-CD71-CD90-CD117-CD123+CD96+CD47+种属来源：鼠正常造血干细胞分选标记:Lin-Sca-1+c-Kit+CD34-Flk2-或者 Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48-MLL-AF9 AML白血病干细胞的分选标记:Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32+CD34+或 c-Kit+Gr-1-BCR-ABL CML 白血病干细胞的分选标记:Lin-Sca-1+c-Kit+,第四十一页，共五十二页。,分选仪器(yq)的比较,石英杯激发原理：激光检测是在石英杯中进行的优点：比色皿提供层流(cn li)和增强的样品聚焦，对于敏感性来说，石英杯激发系统明显占优。缺点：石英杯长度有限，而且激光光学装置需要足够空间避免不同通道间的串扰，细胞需要通过不同的介质，且速度不一样，高速下细胞密度变大，与流动池和喷嘴接触面变大，不能保证在液滴延迟时间内到。,空气激发原理(yunl)：激光检测是在细胞通过喷嘴后的液滴中。优点：硬件设备简单，检测点与收集装置间距离较短，检测样品的可用的激光数多，液流更稳定，能在高速情况下准确在液滴延迟时间内到达。保持细胞清洁的更好，并且能提供额外的激光束。缺点：对于敏感性来说，空气激发不那么敏感。,第四十二页，共五十二页。,补偿计算(j sun)的量化精确调整,购买补偿微球（comp-beads），标记实验中所需要涉及的抗体，孵育后作为(zuwi)单阳补偿管，进行上样通过圈门调整微球群中位数，修正所有补偿。建立良好的补偿