2022年医学专题—发酵工程技术制药(1).ppt

发酵(f jio)工程制药,第一节：微生物细胞工程（发酵工程制药）生产原理第二节：利用微生物进行(jnxng)药物的生产实例,第一页，共七十页。,一、发酵生产(shngchn)过程,生产用菌种-原始材料-培养基-程序(chngx)-生产细则-以青霉素为例讲解,第二页，共七十页。,（1）青霉素（penicillin）,所用菌种-黄青霉菌原始材料(cilio)-氨基已二酸、半胱氨酸、缬氨酸。发酵方法-加前体物质的深层发酵法。,青霉素发现者弗莱明,第三页，共七十页。,沙土管菌种转移到固体琼脂斜面(ximin)培养基上，24培养5-6天，获得芽孢芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养,进入移种瓶培养进种子罐，接种量为5%-10%进繁殖罐，28培养48-96小时(xiosh)进入发酵罐，开始生产。,鼓式过滤第一次萃取(cuq)器纯化柱第二次萃取器第三次萃取器,真空结晶釜瓷过滤器结晶洗涤釜真空干燥器（结束）,程序,第四页，共七十页。,（1）使用消沫剂，由于发酵过程中产生大量的CO2，会产生大量泡沫。可采用植物油、豆油、合成消沫剂进行消沫处理。（2）温度控制在24-30、PH值控制在6.8-7.2。（3）应该注意控制残糖量、还原(hun yun)糖量、PH值、氨、氮、溶解氧量。（4）发酵过程中要注意通气搅拌，所通入的空气必须是无菌的。（5）发酵罐必须保持正压（20-30kPa），以防罐外不洁净的空气流入。（6）目前国际上青霉素发酵的水平已经达到8万多单位/ml，相当于50g/L。,生产(shngchn)细则,第五页，共七十页。,二、灭菌(mi jn)技术,灭菌操作是为了(wi le)保证杂菌不进入工业发酵系统。（一）灭菌项目（二）灭菌方法（三）灭菌的矛盾之处（四）具体的灭菌技术,第六页，共七十页。,（一）灭菌(mi jn)项目,1、在投入生产之前，必须对设备、管道进行彻底清洗、和严格灭菌(mi jn)。2、对通入的培养基、通入的空气进行先行灭菌。,第七页，共七十页。,（二）灭菌(mi jn)方法,2、化学法,1、加热法,3、辐射(fsh)法,4、过滤法,第八页，共七十页。,（三）灭菌(mi jn)的矛盾之处,对杀灭细菌的同时(tngsh)1、培养基中的营养成份也随之遭到分解和破坏。2、杀死杂菌的同时也杀死了工程细菌。,第九页，共七十页。,（四）具体的灭菌(mi jn)技术,可分为6种技术：1、间歇(jin xi)灭菌法2、加热灭菌法3、连续灭菌法4、空气加热灭菌法5、空气过滤灭菌法6、营养物质瞬时高温杀菌法,第十页，共七十页。,1：间歇(jin xi)灭菌法,又称为(chn wi)分批灭菌，是指将培养基放在发酵罐内，然后连罐加热到规定的灭菌温度。（1）灭菌方法（2）注意事项（3）间歇灭菌法的优点,第十一页，共七十页。,（1）灭菌(mi jn)方法,间歇灭菌的操作过程分为3个过程：加热-保温维持-冷却(lngqu)。这些不同的阶段，均能够起到灭菌的作用。然而，在灭菌过程中，保温杀菌的作用是主要的，冷却杀菌的作用最小。,第十二页，共七十页。,（2）注意事项,应当避免过长的加热时间，否则常常会破坏培养基中的营养物质。系统经过灭菌操作之后，必须达到不留1个杂菌，否则，只要经过1昼夜的增殖，1个杂菌就会增加(zngji)到272个杂菌，最后会导致整批发酵液的失败。,第十三页，共七十页。,（3）间歇灭菌(mi jn)法的优点,设备(shbi)造价低廉。便于进行手动操作。,第十四页，共七十页。,2：加热(ji r)灭菌法,隧道(sudo)灭菌箱设备,第十五页，共七十页。,3：连续灭菌法,（1）定义（2）技术分类（3）连续灭菌法的优点(yudin)（4）连续灭菌法的不足,第十六页，共七十页。,（1）定义(dngy),连续灭菌法是指灭菌的操作(cozu)的加热、保温维持、冷却这三个过程，在同一时间内进行。因此，在连续灭菌系统中，需要分别设置加热设备、保温维持设备、冷却设备。,第十七页，共七十页。,（2）技术(jsh)分类,连续灭菌法可以分为2种：（1）加热、冷却缓慢(hunmn)交替进行方法。（2）迅速升温+闪急冷却方法-这种方法称为HTST方法，这对于保证营养物质极为有利。,第十八页，共七十页。,（3）连续灭菌法的优点(yudin),（1）可减少培养剂中营养物质的损失、提高产物收率。（2）由于操作条件恒定，可以获得稳定的灭菌质量。（3）容易实现自控操作。（4）能够避免系统的反复加热(ji r)和冷却，可提高热利用率。是目前很多制药厂经常采用的方法。,第十九页，共七十页。,（4）连续灭菌法的不足(bz),（1）投资较大，（2）需要同时(tngsh)设置加热、冷却装置。,第二十页，共七十页。,4：空气加热(ji r)灭菌法,利用空气压缩时产生的高温，使得微生物体内的蛋白质变性，而达到杀菌目的，这种方法称为空气加热灭菌法。不同温度下的空气细菌存活(cn hu)时间：200/15.1s，250/5.1s，300/2.1s，350/1.05s。干热杀菌的流程通常是：先采用废热，将空气预热到60-70，然后进入压缩机压缩，并在200以上的温度维持一段时间。以便杀死杂菌，然后再进入发酵罐之中。,第二十一页，共七十页。,5：空气过滤(gul)灭菌法,是指让空气通过过滤介质(jizh)，以阻截空气中所含的微生物，取得无菌空气的目的。空气过滤分为2种：（1）绝对过滤（2）深层过滤,陶瓷(toc)过滤机,第二十二页，共七十页。,（1）绝对(judu)过滤,如超滤膜过滤(gul)就属于绝对过滤(gul)是指所用滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。从而把颗粒截留。,第二十三页，共七十页。,（2）深层过滤(gul),是凭借滤层内的曲折通道，而将颗粒截留的方法。它不要求滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。这是目前发酵工业常用(chn yn)的过滤除菌方法。深层过滤所用的过滤介质-棉花、活性碳、玻璃纤维、合成纤维、各种有机或无机的烧结材料（烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料、蒙乃尔合金粉烧结板）、超细玻璃纤维、超细玻璃纤维过滤纸，微孔聚合物（聚乙烯醇PVA过滤板、PVA烧结板等已经在日本的发酵工业中广泛应用）。,第二十四页，共七十页。,6：营养物质瞬时高温(gown)杀菌法,一般来说，当温度升高时，微生物死亡速率的增加(zngji)营养物质遭到破坏的速率。因此，对于瞬时的高温，细菌常常被杀死，而营养物质则破坏得不多。根据这一原理，可以采用营养物质瞬时高温杀菌法进行杀菌操作。,第二十五页，共七十页。,三、分离纯化(chn hu)技术,微生物的发酵产物是一种混合物，里面(lmin)除了含有主要产物以外，还含有未能转化的基质和底物、残余的原料、大量的水、微生物细胞、各种杂质。因此，必须对发酵产物进行分离和纯化。分离和纯化过程被称作“下游加工过程”，需要经过以下这几个阶段：（一）固体物质的去除，（二）初步分离，（三）产品提纯，（四）产品的最终分离。,第二十六页，共七十页。,（一）固体物质(wzh)的去除,1、目的2、常用(chn yn)的方法有3、常用的设备4、固体物质的前期预处理技术,第二十七页，共七十页。,1、目的(md),（1）分离(fnl)出完整的细胞。（2）将细胞进行溶菌处理，提取细胞内的生物产品。（3）除去细胞有残留碎片。（4）除去没有转化的不溶性基质。（5）一部分细胞返回到反应器内，进行再循环操作。,第二十八页，共七十页。,2、常用(chn yn)的方法,（1）过滤法-分批过滤、连续真空过滤、错流流动过滤。错流流动过滤法-使液体平等于过滤膜的表面进行流动，这样能够不断地移去在滤膜表面积累的细胞物质，从而获得近似于恒定(hngdng)的过滤速率。（2）离心分离法-垂直式离心、水平式离心。（3）沉降法-与一般的自由沉降不同，工业生产过程的沉降都属于干扰式沉降。,第二十九页，共七十页。,3、常用(chn yn)的设备,（1）过滤设备-板框过滤机、回转真空过滤机（2）离心设备-转篮式离心过滤机（三足式离心过滤机）、刮刀卸料式离心过滤机、沉降(chnjing)式离心过滤机、喷雾离心过滤机、间断排料式离心过滤机、倾析式离心过滤机。（3）沉降设备-管式离心沉降机。,第三十页，共七十页。,4、固体物质(wzh)的前期预处理技术,由于生物反应液的粘度很大，直接分离往往比较困难，因此，常常(chngchng)对其进行预先的前期处理，来提高分离效果。常见的预处理技术有：（1）使细胞老化凝聚成团，（2）加热，（3）改变PH值，（4）添加化学物质促进凝聚，如加入高分子电解质、氯化钙、胶态粘士。,第三十一页，共七十页。,（二）初步(chb)分离,进一步把已经分离的溶液浓缩，提高目的产物(chnw)浓度的方法，称为初步分离。初步分离的具体方法可以分为：1、蒸发2、萃取3、沉淀4、膜分离,第三十二页，共七十页。,1、蒸发(zhngf),蒸发是通过加热，使溶液中的水经过汽化除去要提高溶质浓度、为溶质的析出创造条件的一种操作方法。各种代谢物，如氨基酸、抗生素、酶都可以进行蒸发操作。由于生物产品大多数是热敏性物质(wzh)，所以物料在蒸发器内的停留时间必须尽可能短，同时，还应该昼避免局部液体过热。,第三十三页，共七十页。,LG系列(xli)离心式刮板薄膜蒸发器示意图,蒸发设备（1）连续流动(lidng)膜式蒸发器，（2）长管膜式蒸发器，（3）强制膜式蒸发器，（4）离心膜蒸发器。,第三十四页，共七十页。,2、萃取(cuq),萃取是通过物质在2种溶液之间不同的溶解度，来实现分离的操作方法。萃取的分类(fn li)（1）有机溶剂萃取（2）双水相萃取,第三十五页，共七十页。,（1）有机(yuj)溶剂萃取,许多抗生素都能够溶解在有机溶剂之中，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、因此，通过萃取，可使得抗生素从水相进入有机相之中，从而实现分离。由于抗生素在有机溶剂之中极不稳定，因此，在保证萃取效率的前提条件下，必须(bx)尽量缩短操作时间。有机溶剂萃取设备可使用Podbielniak离心萃取机。,第三十六页，共七十页。,SFT-150超临界萃取(cuq)反应仪,利用萃取法来提取抗生素，具有质量好、收率(shu l)高、速度快的优点。双水相萃取法，目前用于进行酶、和蛋白质的提取工艺。,第三十七页，共七十页。,（2）双水相萃取(cuq),使用2种互不相溶的高聚物，如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖，分别将它们溶于水中形成双水相，利用目的产物在双水相中不同的分配系数而实现分离的方法(fngf)，称为双水相萃取。萃取之后的目的产物可以通过超滤法进行提纯。双水相萃取材料-（1）PEG-葡聚糖萃取系统，（2）PEG磷酸钾萃取系统。,第三十八页，共七十页。,3、沉淀(chndin),蛋白质在溶液中具有“等电点”的特性，而且其等电点与溶液PH值有关，PH值大，蛋白质呈负电，PH值小，蛋白质呈正电，当PH=pI（等电点）时，蛋白质不带电荷。蛋白质在PI时的溶解度最小。这是因为蛋白质在水中有均匀分布是由于同性电荷相斥的缘故，当PH=pI时，由于蛋白质分子不带电荷，于是(ysh)开始相互凝聚、产生沉淀。,第三十九页，共七十页。,NSG-630浓缩(nn su)分离机,ZHN系列(xli)真空浓缩罐,第四十页，共七十页。,沉淀(chndin)和盐折的结合,由于沉淀常常导致蛋白质变性而失效。而利用盐溶液就能避免蛋白质的变性，这种方法就称为-盐析法。在不同(b tn)的盐溶液之中，蛋白质有盐析效应有所不同(b tn)。按下列顺序递减：（1）阴离子-柠檬酸盐-3、酒石酸盐-2、SO4-2、F-、IO3-、H2PO4-、醋酸盐-、B2O3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、ClO4-、CNS-。（2）阳离子-Th+4、Al+3、H+、Ba+2、Sr+2、Ca+2、Mg+2、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+。从离子物性来看，硫酸铵并不是盐析效应最强的盐类，但是由于它在水中的溶解度极大，对盐析十分有利，因此硫酸铵是目前最常用的盐析剂。,第四十一页，共七十页。,4、膜分离,膜分离